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以页岩陶粒（sc）和活性氧化铝（aa）为填料，构建日处理量为0.46 m3 / d的中试规模两级潮汐流人工湿地tfcw（sc-aa-tfcw），用于低温（<15℃）营养物质的去除。sc-aa-tfcw对氮和磷的去除率分别为78.1%和98.3%。sc-tfcw对有机物的去除率为55.2%，对颗粒物的去除率为85.6%。在17种反硝化细菌中，好氧反硝化细菌（adnb）的绝对丰度最高，其次是兼性厌氧反硝化细菌（fadnb）和自养反硝化细菌（audnb）。氮同化为有机氮、异化同化硝酸盐还原和完全反硝化(完全脱氮)可能是氮代谢的主要途径。一些好氧反硝化细菌（adnb）（如zoogloea, pseudomonas和acidovorax）与营养物质去除相关的关键功能基因之间存在正交互作用。溶解氧和还原元素是改变好氧反硝化细菌（adnb）组成的主要环境因素。 这项研究强调了好氧反硝化细菌（adnb）的重要性及其在sc-aa-tfcw中对多孔基质的协同作用。
与城市污水相比，来自一些公共建筑和居民区的分散式生活污水通常营养物浓度较低，分布较广。人工湿地（cws）被认为是氮（n）和磷（p）净化的有效且低成本的选择，它主要依赖于底物和微生物通过复杂的物理、化学和生物过程的协同作用。然而，对于低温下总氮（tn）和总磷（tp）的高效稳定去除仍然是一个挑战，尤其是在低温条件下，总氮（tn）和总磷（tp）的去除率分别低于50.4%和28.2%。溶解氧（do）不足会降低氮的生物降解，传统基质（如砾石和沙子）的低吸附容量限制磷的吸附。因此，如何提高基质与微生物的这种协同作用是人工湿地（cws）处理分散生活污水的关键。
潮汐人工湿地（tfcws）作为改良的人工湿地，可以在不增加曝气量的情况下，通过“淹没/浸润”和“排水/闲置”阶段的有节奏循环来改变厌氧和好氧环境。另外，近年来，多孔基质在tfcw中得到了广泛应用，这不仅是由于对微生物具有良好的吸附性能和栖息环境，而且在多孔基质中通过“潮汐操作”进行良好的复氧，有利于同步硝化反硝化（snd）过程（在处理系统中，硝化和反硝化反应往往发生在同样的处理条件及同一处理空间内）。之前的研究发现在tfcw中引入生物炭，获得了较高的nh4 -n去除效率。同时，提出沸石对nh4 -n的快速吸附和生物降解动态过程理论。然而这些单级tfcws在同步硝化反硝化（snd）过程后期不能调节溶解氧（do）和有机碳源供应，导致no3--n积累（>10mg/l），总氮（tn）净化性能不理想。此外，磷吸附基质（如天然黄铁矿、铝土矿和泥炭）被广泛应用于人工湿地（cws）中，以提高总溶解磷（tdp）的去除率。然而，很少有人研究去除人工湿地生活污水中主要的p污染物-颗粒磷（pp）。活性氧化铝（aa）具有比表面积大、多结合位点等优点，在tfcw中具有很好的同时去除总溶解磷（tdp）和总氮（tn）的能力，同时，活性氧化铝（aa）的高孔隙率可能增加单级tfcw的堵塞风险。与aa相比，页岩陶粒（sc）粒径较大，是去除颗粒磷（pp）的理想选择。因此，有必要设计一个两阶段的tfcw，将页岩陶粒（sc）设置为第一阶段，将活性氧化铝（aa）设置为第二阶段，从而有效去除总磷（tp）并延长cws的使用时间。两阶段的tfcw可以调节不同的再氧化条件和有机碳源供应，从而在低温下实现有效的总氮（tn）去除性能。
微生物在人工湿地的污染物清除中起着关键作用。研究发现基于传统砾石的两级人工湿地深度测序在第一阶段成功培养反硝化微生物，在第二阶段成功发现了氨氧化细菌（aob）。同样，多级垂直流人工湿地通过提高细菌的丰度从而进一步促进沸石，页岩和陶粒对氮的转化。活性炭和陶粒在人工湿地中的组合施用通过硝化，好氧反硝化和厌氧反硝化促进了nh4 -n的去除。此外，铁碳人工湿地同时增强了异养和自养反硝化对no3--n和tdp去除的协同作用。上述研究主要指出功能菌属与氮去除之间的潜在关系。然而，很少有人关注尤其是在低温下人工湿地中的微生物种间相互作用或它们的协同作用。此外，有些研究在实验阶段末期强调氮代谢关键基因的重要作用，而忽视了与氮磷去除相关的关键基因和功能菌属在整个人工湿地运行过程中的协同作用。更重要的是，准确反映了不同运行阶段样品中微生物的绝对丰度的16s扩增子绝对定量测序技术在这些人工湿地中还没有得到应用。此外，基质特性及其变化也会影响功能菌属组成和污染物去除途径，然而，在低温下人工湿地中，与氮和磷去除相关的功能菌属与受基质影响的环境因子之间的相互作用仍不清楚。
在此基础上，构建了一个第一级sc-tfcw和第二级aa-tfcw的两级中试规模tfcw，命名为sc-aa-tfcw。本研究的具体目标是：1）研究低温（<15℃）下氮、磷的去除性能，并探讨tfcw不同阶段污染物去除的主要贡献；2）用16s扩增子绝对定量测序技术确定微生物群落和功能菌属的变化；3）揭示启动和稳定阶段的氮和磷代谢途径； 4）确定与氮磷去除相关的功能菌属、关键代谢基因和环境因子之间的联系。基于以上结果，阐述了多孔基质与微生物协同去除污染物的能力。
基质：
sc和aa的粒径分别在15~20mm（d80=17mm）和5~8mm（d80=6mm）之间。采用多点brunauer-emmet-teller n2吸附-解吸等温线测定了基质的比表面积、孔体积和平均孔宽。用x射线衍射（xrd）和x射线荧光光谱仪（xrf）对基体中的主要无机化合物进行了分析。
sc-aa-tfcw的构建和运行：
实验是在中型sc-aa-tfcw上进行的，该sc-aa-tfcw由sc-tfcw和aa-tfcw组成，并具有相同的配置（长×宽×高= 1000 mm×800 mm×800 mm）。每个下行tfcw主要由入口区、基底区和出口区组成（图1）。相邻区域由隔板隔开，隔板上有均匀分布的小孔，用于分配水。在进水区，建立了由多孔pvc管组成的水分配器，以实现均匀的水分配。基底区域（长×宽×高=1000mm×800mm×600mm）全部填充sc或aa。美人蕉（canna indica l.）以16株/m2的初始密度种植在每个tfcw基质区上表面。为了保持进水水质稳定性，合成废水的平均浓度保持在300 mg / l化学需氧量（cod），40 mg / l nh4 -n，5 mg / l总氧化氮（ton，亚硝酸盐和硝酸盐之和），2 mg / l pp和4 mg / l tdp。根据这些平均值，分别用葡萄糖，nh4 cl，kno3，骨粉（直径<0.074 mm）和kh2 po4制备合成废水。
sc-aa-tfcw通过自动控制系统连接，该系统由进水箱，污水泵，电磁阀和液位传感器组成。“潮汐运行”模式（填充-接触-排水-休息）的实施策略如下：1）为了在启动阶段（从第1天到第41天）在sc和aa中更快地进行生物降解，进水池的废水通过启动泵、电磁阀1和电磁阀2快速（3分钟）加载到sc-tfcw上，接触时间为2小时，之后通过启动泵、电磁阀3和电磁阀4将所有废水快速（3分钟）加载到aa-tfcw上，并与基质保持接触2小时，然后启动电磁阀5将废水快速排出；2） 为了在稳定阶段（第42天至第114天）更稳定地去除氮和磷，在其他操作参数不变的情况下，aa-tfcw的接触时间从2小时延长到10小时。
样品采集与测定：
每周两次从每个tfcw的入口和中间收集水样。根据标准方法（apha，2012）测量了包括cod、nh4 -n、no2−-n、no3−-n、tn、tdp、pp和tp等参数。借助于便携式hach hq30d多参数分析仪测量溶解氧（do），ph和温度。在第10天、第41天、第60天和第114天，从每个tfcw的中间位置采集三份微生物样本，将三份样品混合作为一个生物膜样品，用于进一步的微生物分析。本研究采集了8个生物膜样品，包括sc10、aa10、sc41、aa41、sc60、aa60、sc114和aa114。
16s扩增子绝对定量测序：
使用e.z.n.a.® soil dna kit (omega biotek, u.s.)从8个生物膜样品中提取微生物dna。dna样品送至上海天昊生物科技有限公司进行16s rrna扩增子绝对定量测序（v3-v4）。
污染物去除总体性能
在启动阶段，sc-aa-tfcw（图2a-c）中，cod、nh4 -n和tn的去除率比稳定阶段波动更大（图2a-c），这是由于基质上的hl较高和生物膜未成熟造成的。有研究报道随着生物降解的增强，sc-aa-tfcw在低温下达到稳定的去除性能需要约41天，比其他人工湿地（cws）缩短20~40天。因此，高hl有助于多孔基质上生物膜的形成，从而实现sc-aa-tfcw中污染物的去除。在稳定阶段，平均出水化学需氧量（cod）稳定在33.5±2.4 mg/l，在低温（<15℃）下去除率为90.5%。此外，tfcw第一阶段和第二阶段的cod去除率分别为55.2%和35.3%。根据之前研究，有机物是人工湿地（cws）堵塞的一个重要因素。水力停留时间（hrt）为2h时，sc-tfcw对cod的降解贡献最大，而水力停留时间为10h时，aa-tfcw的cod负荷较低，因此，两级设计可以降低aa-tfcw的堵塞风险，保证低温下cod去除性能稳定。nh4 -n和tn的出水浓度分别为7.72±0.5和9.39±1.4 mg/l，相应的去除率分别为80.7%和78.1%，优于其他类型的两级人工湿地。sc-tfcw对nh4 -n和tn的去除率分别为42.2%和36.9%。此外，从第50天到第60天，sc-tfcw对nh4 -n和tn的去除率表现出明显的波动，这可能是由于进水温度较低（<8°c），抑制了去除氮的功能菌属。因此，aa-tfcw进一步去除了nh4 -n，对tn的去除率为41.2%。综上所述，sc-aa-tfcw在低温条件下保证了cod、nh4 -n和tn的高效稳定去除。
sc-aa-tfcw具有高效的tp去除性能（图2d），在启动和稳定阶段，平均出水tp为0.36±0.12和0.09±0.03 mg/l，tp去除率分别为94.0%和98.3%。基质吸附和沉淀是人工湿地除磷的主要机制，基质的选择和人工湿地（cws）的设计对于长期高效稳定的除磷至关重要。具体而言，sc-tfcw在有效去除pp方面具有优势，并且可以在较短的hrt（2小时）下降低堵塞风险。此外，据报道，aa对tdp具有较大的吸附容量。aa-tfcw平均进水tp为2.51mg/l，约占tp原水的三分之一，延长了aa-tfcw的使用时间。因此， sc-tfcw缩短的水力停留时间和aa-tfcw较低的tp负荷不仅可以保证稳定的tp去除，而且可以延长sc-aa-tfcw的使用寿命。综上所述，sc-aa-tfcw在低温下具有良好的脱氮除磷性能。
sc-aa-tfcw中氮磷转化动力学研究
为了更好地理解氮和磷的转化过程，展示了一个典型循环中nh4 -n、no2 −-n、no3 −-n、tn、pp、tdp和tp的变化（图3）。nh4 -n和tn在10h内同时被去除，并在最后2h内保持稳定（图3a）。在整个循环过程中，没有观察到明显的no2 −-n或no3 −-n的积累。另外，前4h总氮去除率为28.5mg/l，占总去除量的78.9%。总的来说，有报道表明tn可以通过异养和自养反硝化去除，而前者的速度要快于后者。本研究中在前4小时，sc-aa-tfcw中的cod/tn比值在6.68到5.01之间（图3b）。同样，在该阶段可以保持有氧环境，其溶解氧梯度范围为5.21-1.53 mg / l（2 h）和4.72-1.64 mg / l（2 h）。这些结果表明，在tfcw中高cod / tn比（> 5.0）下，好氧反硝化可以有效地去除tn，这得到了我们先前的研究的支持。此外，有报道表明周期性复氧的好氧环境比传统人工湿地（cws）更为密集，可以促进nh 4-n的去除，sc-aa-tfcws中的氧扩散也比人工曝气人工湿地（cws）弱，这阻止了大量no3 −-n的积累。因此，多孔基质周期性复氧更有利于低温好氧反硝化。
在sc-aa-tfcw中，tp在8 h后稳定在0.1 mg / l以下（图3c）。在本研究中，tp的净化性能可以通过tdp和pp的去除来体现。其中，以aa-tfcw为主，对tdp的去除率为69.5%。另外，sc-tfcw对pp的去除率为85.6%。一方面，有报道表明tdp的化学吸附受ca、fe或al及其氧化物和氢氧化物含量的强烈影响。铁铝氧化物是sc去除tdp的主要磷结合物（图3d）。至于aa，大量的铝氧化物/铝氢氧化物可生成-oh替代磷酸盐离子，因此，配体交换可能是tdp去除的主要途径。另一方面，有报道表明pp通常通过物理吸附去除。sc上最密集的孔径分布在22.4～115.1nm之间，主要分布在中孔（2～50nm）和大孔（>50nm），该结果表明sc-tfcw有助于中孔和大孔对pp的大部分去除。而在aa上，孔径分布在1.88～6.49nm之间，多为微孔（<2nm）中孔结构。因此，配体交换的化学吸附和基质上大孔和中孔的物理吸附分别是sc-aa-tfcw去除tdp和pp的主要途径。
与氮磷去除有关的功能菌属的变化
在sc-aa-tfcw中，鉴定出47个优势菌属（至少一个样本>1500 copy/ng dna）（图4a）。其中与脱氮除磷有关的17属占总拷贝数的83.2%，因此，它们的动力学可能为低温下有效的脱氮除磷奠定了基础。具体来说，ferribacterium以低拷贝数存在于页岩陶粒（sc）上。但在aa10和aa41上迅速富集，在aa60和aa114上逐渐减少，这说明ferribacterium在有氧条件下更容易在活性氧化铝（aa）上存活。根据以往的研究，ferribacterium不仅与no 3−-n异化还原为nh 4-n呈正相关，而且ferribacterium也被报道为好氧反硝化细菌（adnb），在同步硝化反硝化（snd）过程中同时实现废水nh 4-n和tn去除。与ferribacterium不同，zoogloea是一种典型的反硝化菌，在低温下对sc和aa都有很好的适应性。在启动期和稳定期，zoogloea数量迅速增加，达到6.1×104 copy/ng dna以上，表明其可能是低温环境下脱氮的关键好氧反硝化细菌（adnb）。此外，有研究已证明pedobacter可决定硝化过程，发现在8.5℃的温度下富集在sc10和sc41上，然而，很少在sc60和sc114上检测到（<500 copy/ng dna）。这一变化表明，土壤细菌在启动阶段能够迅速繁殖并参与脱氮，在稳定阶段随着其他细菌的富集逐渐丧失优势。研究报道acidovorax、thauera、dechloromonas是典型的adnb，在sc-aa-tfcw中实现有机物和nh 4-n的同时去除性能，而无需no3 −-n的积累。这些功能菌属在低温下适应迅速，持续生长繁殖，成为sc-aa-tfcw的优势菌。
至于其他与脱氮有关的属，gemmobacter被认为是处理实际生活污水的典型缺氧反硝化菌，并在sc114和aa114上富集，其绝对丰度分别为591 copy/ng dna和6745 copy/ng dna。此外，据报道，propionivibrio和pseudoxanthomona是缺氧生物反应器中主要的反硝化菌，可同时减少no 2−-n和no 3−-n。在本研究中，propionivibrio和pseudoxanthomonas在sc-tfcw中快速富集，在aa-tfcw中也检测到大量（>3000 copy/ng dna）。因此，gemmobacter,propionivibrio和pseudoxanthomonas存在于好氧/间歇好氧环境中，可推断为兼性厌氧反硝化细菌（fadnb）。在稳定期，hydrogenophaga逐渐增多，在sc114和aa114中分别占1.36%和7.11%。研究报道hydrogenophaga可以作为自养反硝化细菌（audnb）从还原物质（如氢离子和亚铁离子）的氧化中获取能量来进行脱氮。x射线荧光分析表明，sc和aa中含有丰富的还原元素（如al、fe和ca）。这些元素可能在复杂的物理、化学和生物过程中产生还原物质，促进hydrogenophaga自养反硝化。在启动阶段，所有adnb、fadnb和audnb分别占总微生物组的92.7%、4.78%和2.49%，在稳定阶段分别占66.19%、19.1%和13.8%（图4b）。在自养属中，启动期aob（主要是nitrosomonas）和nob（主要是nitrospira）很少在sc-aa-tfcw中检测到，在稳定期（每个样品中<500 copy/ng dna）以低数量存在。因此，adnb、fadnb和audnb可能是低温高效脱氮的主要微生物途径。
在人工湿地中，微生物磷去除通常被忽略。而sc-aa-tfcw的平均磷出水浓度在稳定阶段由0.242mg/l下降到0.105mg/l，因此，应注意潜在菌属对磷去除的重要作用。据报道，dechloromonas是去除营养物质的反硝化聚磷菌，在sc-aa-tfcw中，dechloromonas为优势属，稳定期的绝对定量范围为3274～15976 copy/ng。hydrogenophaga还可以同时去除纺织废水中的氮和磷。因此，dechloromonas和hydrogenophaga可能在sc-aa-tfcw中对磷的去除起重要作用。
启动期和稳定期不同的氮磷代谢途径
为了揭示sc-aa-tfcw脱氮除磷机理，根据keeg数据库对关键功能基因和代谢途径进行了鉴定。本研究中编码关键酶的功能基因主要涉及硝化、反硝化、异化no3 −-n还原、同化no3 −-n还原、nh4-n向有机氮（org-n）的同化、聚磷酸盐（poly-p）的聚集和降解。如图5所示，催化nh4-n氧化的关键编码基因（amoabc和hao）与其他关键基因相比拷贝数较低。此外，amoabc在启动阶段很少被检测到，结果表明，nh4-n氧化在启动阶段几乎没有发生，因此，该阶段nh4-n的去除可能主要参与其它代谢途径。提出了启动阶段nh4-n去除的两种可能途径：一方面，基因组功能注释发现大量谷氨酸脱氢酶（glna和glu）基因（3.57×105 copy/ngdna）,谷氨酸脱氢酶能将nh4-n转化为谷氨酸，促进细胞生长，从而消除nh4-n。根据先前的研究，nh4-n同化为org-n的这一途径已被证明是一个主要的异养nh4-n消除过程。另一方面，据报道，nh4-n作为诱导剂参与no 3−-n还原过程, 在本研究中，与异构化和反硝化相关的no 3−-n还原基因（napa、napb和narg）明显高于no 2−-n还原酶编码基因（nira）。因此，nh4-n同化为org-n，异化no 3−-n还原可能是启动阶段nh4-n转化的主要途径。
稳定期的关键编码基因总数大多低于启动期。然而，催化nh4-n氧化的编码基因（amoabc和hao）总体呈上升趋势,这一结果似乎是对硝化细菌富集的反应，并进一步导致nh4-n去除率的增加。此外，与反硝化作用有关的功能基因全都占主导地位（> 2.21×105 copy/ngdna）。尤其是，narg和nap型基因甚至超过1.22×10 6 copy/ngdna。结果表明，在间歇好氧条件下，sc-aa-tfcw能有效地促进no 3−-n的还原过程，这与no 3−-n的高效去除是一致的。另外两个关键基因，一氧化氮还原基因（norc）和一氧化二氮还原基因（nosz）分别是no2−-n还原基因（nirk）的1.78倍和2.34倍。结果表明，sc-aa-tfcw中的反硝化过程更倾向于以n2为最终产物进行。根据目前的知识，反硝化细菌可以通过多种基因的共存来实现完全的反硝化(no3−-n → n 2 )，因此，与启动阶段相比，稳定阶段高效的nh4-n和tn去除可能比启动阶段（包括硝化和完全反硝化）有更多的氮代谢途径。
多磷酸激酶（ppk）和胞外多聚磷酸酶（ppx）的关键编码基因参与了磷转化。poly-p在厌氧条件下首先降解（ppx）并释放po43−-p。同时，废水中po43−-p的吸收，通过ppk基因增加细胞内的聚磷，最终实现生物除磷。如图5所示，ppk和ppx在1.34×104 copy/ngdna上都可以检测到。尽管启动期与磷代谢相关的关键基因高于稳定期，但好氧环境可能不利于聚磷的降解，相反，aa-tfcw间歇好氧条件可能会加速po43−-p的释放和吸收能力，从而稳定地去除磷。
功能菌属、关键基因与环境因子的联系
利用网络分析方法研究了sc-aa-tfcw功能菌属与关键基因的相互作用。在16个功能菌属和18个关键基因中发现了60个显著和强相关的关系（图6a）。具体而言，zoogloea、pseudomonas、ferribacterium和acidovorax为核心的adnb，与其它细菌属呈正交互作用。这些adnb不仅主要通过携带narg、napa、napb、nirk、norc和nosz等多种反硝化基因参与完全反硝化（no3−-n→n2），而且还与nirb、nird、nasa和nira参与异化/同化no3−-n还原有关。nitrosomonas是nh4-n氧化的优势宿主，携带amoa、amob、amoc和hao。特别是，作为一种adnb，dechloromonas也显示出与hao的密切关系，表明硝化作用对nh4-n的去除可能存在潜在的关系。此外，dechloromonas，hydrogenophaga和pseudoxanthomonas与glna或glu呈正相关，它们可能存在nh4-n同化作用。因此，adnb携带了反硝化、异化/同化no3−-n还原和nh4-n同化等多种关键基因，主要参与低温下nh4-n和tn的去除。在磷转化方面，fadnb（如propionivibrio）和adnb（如acidovorax、pseudomonas和dechloromonas）携带ppx和ppk基因，实现对tp的生物降解。
通过cca和vpa分析确定了功能菌属与6个关键环境因子之间的联系（图6b和c）。这些因素可分为三类：水质（do和ph）、还原元素（fe和al）和基质结构（孔径和比表面积）。adnb和audnb与还原元素和水质呈正相关。此外，网络分析得出的核心adnb（如zoogloea、pseudomonas和acidovorax）是aa上的优势属，与al呈正相关。结果表明，al元素有利于核心adnb的低温高效去除污染物。如图6c所示，还原元素对细菌群落变化的贡献最大（10.6%），其次是水质（7.64%）和基质结构（2.63%）。更重要的是，还原元素和水质对微生物群落的存活率有显著影响，其贡献率为17.16%。值得注意的是，基质是人工湿地脱氮除磷的核心。与其它生物反应器（如好氧颗粒污泥系统和膜生物反应器）不同，人工湿地中的微生物群存在于一个相对稳定的环境中，并且受载体性质的影响很大。具体来说，还原元素al创造了一个微碱性环境，可能有利于各种代谢途径；此外，基板的多孔结构平衡了氧气分布，有利于adnb、fadnb和audnb共存。因此，基质中高含量的al和多孔结构改变了微环境（ph和do），促进了各种代谢途径的协同作用，从而在低温下高效去除氮磷。
sc-aa-tfcw在低温下具有高效的污染物去除性能，sc-tfcw可以降低aa-tfcw的堵塞风险。与fadnb和audnb相比，adnb的绝对丰度最高。nh4-n同化是启动阶段nh4-n去除的主要途径。在稳定期，异化和同化no3—n还原和完全反硝化是tn转化的主要原因。adnb与关键功能基因之间主要存在正交互作用。cca和vpa表明do和还原元素（特别是al）在塑造功能菌属组成中起着重要作用。总的来说，本研究阐明了多孔基质和adnb在去除营养方面的协同作用。
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