西安交通大学第一附属医院近期在国际精神疾病领域顶级期刊《分子精神学》（molecular psychiatry）上发表了移植未经药物治疗的精神分裂症患者肠道微生物会导致受体小鼠出现精神分裂症相关异常行为和犬尿氨酸代谢失调的研究文章，在这项研究中天昊生物有幸承担了微生物测序相关工作。在恭喜客户发表高分文章的同时，我们想跟大家分享一下这篇文章的研究思路。英文题目：transplantation of microbiota from drug-free patients with
schizophrenia causes schizophrenia-like abnormal behaviors and dysregulated
kynurenine metabolism in mice中文题目：移植未经药物治疗的精神分裂症患者肠道微生物会导致受体小鼠出现精神分裂症相关异常行为和犬尿氨酸代谢失调期刊名：molecular psychiatry影响因子：11.973发表单位：西安交通大学第一附属医院
研究概要
越来越多的证据表明，肠道菌群通过菌群-肠-脑轴在精神分裂症的发病机制中起作用。这项研究试图调查将未经药物治疗的精神分裂症患者的肠道菌群移植到spf小鼠是否会导致小鼠出现精神分裂症相关异常行为，结果表明，将精神分裂症患者的粪便菌群移植到spf小鼠中会引起其行为异常，例如精神运动过度活跃，学习和记忆受损，这些小鼠还显示，与接受健康对照组粪便的受体小鼠相比，接受精神分裂症患者粪便的小鼠的外周组织和大脑中色氨酸降解的犬尿氨酸-犬尿酸通路富集，前额叶皮质的基础细胞外多巴胺和海马区的5-羟色胺增加。此外，移植患者粪便微生物群的小鼠的结肠腔内滤液使培养肝细胞和前脑皮质切片中的尿酸合成和犬尿氨酸转氨酶ii活性上调。60种供体来源的细菌在移植患者和对照组粪便微生物群的小鼠之间显示出显著差异，突出了78种不同富集的功能模块，包括色氨酸生物合成功能。总之，我们的研究表明，肠道微生物群组成的异常部分通过色氨酸-犬尿氨酸代谢的调控参与了精神分裂症的发病。
研究背景
精神分裂症是一种慢性严重精神障碍，估计终生患病率为1％，是导致残疾的全球主要原因之一。尽管精神分裂症给公共卫生带来沉重负担，但潜在的发病机理的机制尚未完全了解。数十年的研究表明，遗传因素和环境因素均与精神分裂症的发展相关。肠道微生物组是由遗传和环境因素共同调节的肠-脑轴的关键组成部分，它很可能在宿主生理学和疾病病理生理学方面协同遗传和环境效应。这些肠道微生物也被视为影响神经内分泌功能和大脑发育的重要因素。有趣的是，精神分裂症的几种环境危险因素，包括剖宫产，早期生活压力，饥荒期间母亲营养不良以及孕产妇的免疫激活，都对肠道微生物组产生了深远的影响。 因此，对肠道微生物组的作用进行评估对于全面了解精神分裂症的发病机理和发展是必要的。微生物研究技术的最新进展，例如粪菌移植（fmt）和微生物组关联研究（mwas），是揭示肠道菌群在肥胖，糖尿病，神经系统和神经发育疾病中作用的重要工具。在过去的十年中，肠道菌群在精神障碍的病理生理中的潜在作用引起了人们的广泛关注。尽管据报道一些微生物分类群与精神分裂症和狂躁症有关，但这些微生物丰度变化的功能性潜在后果仍不清楚。最近，使用mwas策略我们观察到与健康对照组相比，精神分裂症患者的肠道微生物组受到干扰（未发表的数据），然而，需要进一步的研究以揭示肠道微生物的组成变化仅仅是生理和生活方式失调的结果，还是在精神分裂症的病理生理中发挥功能性作用。最近的一项研究报告说，来自精神分裂症患者的肠道微生物组在无菌（gf）的受体小鼠中诱导了精神分裂症相关的行为，表明肠道微生物群失调对精神分裂症病理心理学有贡献。移植的外来微生物群相对容易栖息在无菌（gf）小鼠的肠道内，因为几乎没有来自固有微生物的干扰。此外，已知无菌（gf）小鼠表现出肠道和大脑发育失调，并表现出异常行为，例如神经传递失调，运动过度和焦虑样行为减少。先前的报道表明，具有这种缺陷的小鼠由于其固有的病理生理学特性，可能不是研究微生物群对神经化学，神经传递和行为影响的理想模型。因此，本研究选择检查人类微生物群对具有正常大脑发育和功能的无特定病原体（spf）小鼠的影响。由于免疫/炎症，代谢和神经内分泌系统的系统性损伤是精神分裂症的标志性症状，并且此类系统与肠道菌群有关，因此可以想象这些微生物在精神分裂症中起作用。肠道微生物群可以调节下丘脑-垂体-肾上腺（hpa）轴，控制肾上腺皮质激素和皮质酮的释放，而皮质酮在精神分裂症患者中常常是异常的。炎症假说表明，患者体内细胞因子和炎症介质的紊乱以及精神分裂症的临床前模型会驱动疾病症状的发展。细菌分解色氨酸代谢产生的代谢产物可在肠道局部和中枢神经系统远端调节炎症和疾病发展。此外，肠道中的细菌将食物来源的色氨酸分解为一系列神经活性代谢产物，例如犬尿氨酸（kyn），犬尿酸（kyna），喹啉酸（quia）。这些小的分解代谢产物能够远程影响中央谷氨酸和5-羟色胺系统。此外，肠道菌群还调节大脑中去甲肾上腺素，多巴胺和5-羟色胺的代谢。结肠肠嗜铬细胞中5-羟色胺的生物合成受原生孢子形成细菌的控制，γ-氨基丁酸（gaba）由谷氨酸经一系列乳酸杆菌和双歧杆菌物种代谢。因此，这些神经递质可能是肠道菌群与导致精神分裂症的脑病理生理学之间的潜在介体。 由于这些途径和分子在精神分裂症的发病机理和进程中具有至关重要的作用，因此有必要研究哪些调节它们的微生物可能参与精神分裂症的心理病理过程。在这项研究中，我们将精神分裂症患者的肠道菌群移植到spf小鼠，我们的结果提供了进一步的证据，即肠道微生物组的改变会促进精神分裂症相关症状，如精神运动亢进和学习记忆力减退。我们对hpa轴，促炎性细胞因子，色氨酸代谢途径和神经递质系统的分析表明，色氨酸代谢失调，尤其是激活的kyn途径很可能是微生物引起的小鼠精神分裂症样行为异常的原因。
主要研究方法
fmt：将雄性c57bl/6j小鼠用于所有实验，并在标准spf环境下饲养。 根据先前研究中描述的方法，从11名精神分裂症患者（scz）和10名人口统计学匹配的健康对照（hc）中收集粪便样本然后进行微生物菌群移植。简而言之，将粪便悬浮在甘油-pbs液体中，收集后立即离心。混合来自患者或健康对照的含有微生物群的上清液，并用于移植。小鼠肠道菌群的消耗方法参考了之前两项研究中描述的方法。最后一次饲喂抗生素后48小时，将小鼠随机分为两组，分别口服灌胃患者或对照组的微生物群悬液（10μl/g体重），持续3周以重建肠道菌群（以下称为scz小鼠和hc小鼠）。行为测试：所有行为测试均在粪便移植后24小时进行。使用视频计算机跟踪系统对结果进行分析，或者通过手动观察对结果进行评分。在两个独立的实验中进行了两节行为测试： 一种按旷场实验（oft），交互社会互动测验（rsit），三箱社交测验（tcst），新奇事物识别测验和强迫游泳测验的顺序进行；另一个按高架迷宫，巴恩斯迷宫（bm）和悬尾实验的顺序进行。给另外一组小鼠注射mk-801（0.2 mg/kg body weight, i.p.）或盐水，并且它们在30分钟后进行30分钟的旷场实验（oft）。小鼠组织和粪便中的测定：在小鼠实验期间的几个时间点收集粪便颗粒（图s1）。 对粪便样本dna进行宏基因组测序和16s rrna扩增子测序。行为测试后24小时从小鼠体内解剖肝脏，脾脏和肠组织，并从小鼠大脑解剖前额叶皮质（pfc），纹状体和海马。分别采用elisa、超高效液相色谱-串联质谱法和qpcr测定上述组织中几种代谢产物的浓度和色氨酸-kyn-kyna途径中几种代谢酶的mrna水平。用elisa试剂盒和luminex免疫分析试剂盒检测颈部标本血清内毒素、激素、色氨酸代谢产物和细胞因子。培养细胞和脑切片的检测：在fmt结束时从scz小鼠和hc小鼠的结肠以及另外一组正常spf小鼠的结肠中收集内容物。每组6只小鼠的混合结肠腔内容物以125微升/毫克的浓度悬浮于hank平衡盐溶液中，12000×g离心10min，用来自其上清液的结肠腔滤液（clf）对体外培养的细胞和脑片进行刺激。将脑切片在含有spf，hc或scz小鼠结肠腔滤液（clf）或合并了pf-04859989和scz小鼠结肠腔滤液（clf）或单纯含有pf-04859989的培养基中培养24小时。从上述spf环境中饲养的雄性c57bl/6j
spf小鼠（7-8周龄）中分离出混合结肠细胞和肝细胞，人永生化肝细胞（atcc®crl-2706™）和人结肠癌细胞系ht-29（atcc®htb-38™）购自美国模式培养物集存库。为了确定结肠腔滤液（clf）对酶mrna和活性的影响，将上述细胞在含有来自spf，hc或scz小鼠结肠腔滤液（clf）的培养基中在37℃，5％co2条件下孵育24小时。
研究结果
● 粪菌移植可部分重现scz症状
我们通过给spf c57bl/6小鼠提供10天的抗生素混合物，耗尽其体内的微生物群，然后将人scz患者和hcs的粪便灌胃给小鼠（图s1）。对粪便dna浓度和粪便16s rrna基因拷贝数的定量分析表明，抗生素治疗消除了大多数肠道微生物（图s2a，b）。主坐标分析（pcoa）显示，fmt后即刻、10天和14天的肠道微生物组与基线有显著差异（图s2c），这表明人类微生物很容易栖息在小鼠肠道中，并在某种程度上存活了至少2周。此外，接受scz患者粪便的小鼠体内的细菌群落与接受hcs粪便的小鼠体内的细菌群落是分开的。整个过程中体重增长，促炎细胞因子水平，血清中基础皮质酮和内毒素的含量在两组之间没有显著差异，我们观察到主要器官的总体组织学无明显变化（图s3）。对scz和hc小鼠进行了大量的行为测试（图1a）。与基线粪便相比，随着移植后时间的延长，移植后收集的粪便微生物主要成分分离度降低，香农微生物多样性差异减小（图s2d），表明小鼠的人源化肠道微生物群逐渐消失。基于此，我们在fmt后10天内完成了行为测试。scz小鼠在30分钟的oft测试中表现出运动过度行为，包括升高的饲养（图1b）和增加的行进距离（图1c，d）。当scz和hc小鼠被放置在监视箱中时，它们的初始活动水平是相似的，但scz小鼠在正常的10分钟适应期后仍继续过度运动，即使在30分钟后也没有显示出明显的运动活性下降（图1e）。在另一种由mk-801诱导的scz小鼠模型中，进一步研究了肠道菌群对运动的影响，结果表明mk-801和scz患者的肠道菌群均对运动产生显着影响，并且在mk-801给药后，scz小鼠的距离仍比hc小鼠增加（图1f）。此外，scz小鼠在三箱社交测验（tcst）中表现出更多的探索行为，例如延长的总探测时间（图s4a）和长距离旅行（图s4b），表明精神运动亢进。在开放式实验箱中的交互社会互动中，与hc小鼠相比，scz小鼠对之间的交互作用的持续时间和频率显著提高（图1g，h）。巴恩斯迷宫（bm）测试显示，scz小鼠显示出空间学习和记忆受损，因为它们在训练过程中定位逃逸孔的等待时间更长（图1i），并且在探针测试中在目标象限中花费的时间更少（图1j）。此外，一项新的物体识别测试也表明，scz小鼠对先前探索过的物体记忆受损（图1k）。
图1 scz患者的肠道菌群诱导小鼠运动过度行为并损害学习和记忆
● scz小鼠色氨酸代谢的kyn途径上调
色氨酸代谢的微生物调节是肠道菌群调节大脑和行为的关键机制。饮食中的色氨酸主要通过两种途径吸收和分解代谢：kyn途径和5-羟色胺（5-ht）途径（图2a）。首先，我们确定色氨酸向kyn和5-ht的外周分解代谢是否受到外来scz菌群的肠道定植的干扰。随着移植小鼠肠道微生物群逐渐消失，我们在两个时间点（即fmt之后和行为试验之后（移植后10天））研究了色氨酸代谢产物。在scz小鼠中，fmt后血清色氨酸立即下降，行为试验后继续下降（图2b）。在肠，脾和肝中，与hc小鼠相比，scz小鼠的色氨酸水平降低，这与在血清中观察到的结果一致（图s5a）。在fmt结束时，血清5-ht水平下降（图s5b），而kyn上升（图2c），但在10天后恢复到正常水平。相对于hc小鼠，scz小鼠的肠道，脾脏和肝脏中也存在较高的kyn（图s5c）。由于kyn代谢包括kyna和3-羟基犬尿氨酸（3-hk，图2a）两个独立的途径，因此在小鼠中测量了血清和周围组织中kyna和3-hk的浓度，结果发现，与对照组相比，scz小鼠的血清，肝脏，结肠和脾脏中的kyna水平持续升高（图2d和s5d），而外周组织3-hk含量无差异（图s5e）。这些数据表明，scz微生物群的定殖仅沿kyn–kyna途径促进了色氨酸的代谢，并抑制了5-ht途径。
色氨酸代谢受几种限速酶的控制，其中一些酶受肠道微生物群的调节，我们发现，在scz小鼠的肠道、肝脏和脾脏中，催化kyn产生的吲哚胺2,3-双加氧酶1（ido-1）和色氨酸2,3-双加氧酶2（tdo-2）的mrna水平高于正常水平（图2e和s5f）。在催化kyn转氨为kyna的四种犬尿氨酸氨基转移酶（（kat i-kat iv）中，只有kat ii在scz小鼠的外周组织中过度表达（图2f和s5g–i）。与肠道中5-ht的下调一致，色氨酸羟化酶1（tph-1）在scz小鼠的肠壁中表达不足（图s5j），相反，控制3-hk代谢途径的犬尿氨酸3-单加氧酶（kmo）保持不变，与不受干扰的3-hk代谢一致（图s5k）。
令我们惊讶的是，一些已知的ido和tdo表达调节剂，例如促炎细胞因子，lps和皮质酮，在scz小鼠中并未发生明显变化（图s3）。因此，我们假设肠道微生物群来源的因子，例如可溶性代谢产物，是导致色氨酸-kyn-kyna代谢途径改变的原因。因此，我们检测了scz小鼠结肠腔内容物的滤液，并评估了它们对培养的小鼠原代肝细胞和/或混合小鼠结肠细胞中这些酶的活性及其基因表达水平（ido1、tdo2、kat1-4和tph1）的影响。有趣的是，来自scz小鼠的结肠腔内滤液（clf）显著促进了肝细胞和结肠细胞中ido-1的活性和ido1 mrna的转录（图2g和s6a）；scz小鼠的clfs上调了培养的小鼠肝细胞中的kat活性和kat2 mrna，但未上调结肠细胞中的kat（图2h和s6b）。此外，我们评估了clfs在人类永生化肝细胞（crl2706）和结肠上皮细胞（ht-29）中的作用，同样，来自scz小鼠的clf在两种人类细胞类型中均显著促进ido1表达，仅在肝细胞中显著促进kat2表达（图2i）。对结肠细胞或小鼠肝细胞表达的tdo-2和tph-1的mrna水平无明显影响（图s6c，d）。
图2 移植了scz患者粪便的受体小鼠的外周组织色氨酸代谢受到干扰
● scz小鼠大脑中kyn–kyna代谢升高和神经递质改变
外周组织中的色氨酸和kyn能够通过血脑屏障影响脑内稳态。因此，在外周组织中的水平可影响其在脑中的下游代谢，并对中枢神经免疫和神经进行性过程产生影响。因此，我们进一步研究了肠道菌群对中枢kyn代谢和神经递质代谢的影响。行为测试后我们测量了前额叶皮质（pfc），纹状体和海马中的色氨酸，kyn，kyna，3-hk，5-ht及其主要代谢物5-羟基-3-吲哚乙酸（5-hiaa），多巴胺（da）及其代谢物羟基苯乙酸（dopac）和高香草酸（hva），兴奋性氨基酸谷氨酸和抑制性氨基酸4-氨基丁酸（gaba）的水平（表s2）。我们发现，在所有三个区域中，kyn和kyna的浓度均持续升高，而前额叶皮质（pfc）和纹状体中的3-hk降低且da增加，纹状体和海马中5-ht增加，pfc中的谷氨酸和色氨酸增加（图3a-c和s7）。kyna而不是3-hk与它的前体kyn高度正相关，前体kyn可以从血液自由进入大脑（相关系数：0.831-0.909；图3a-c中最右边的图）。在每个大脑区域内，这些色氨酸代谢产物与神经递质之间存在着许多显著的相关性（图s8），其中最值得注意的是，kyn / kyna水平与pfc中的谷氨酸，纹状体中的da以及海马中的谷氨酸和色氨酸呈正相关（图s7），中枢色氨酸代谢产物和神经递质也与小鼠行为相关（表s1），此外，我们发现，pfc中的kyna与认知功能之间显示出最强的负相关性（图3d和e）。
外周组织色氨酸，kyn或kyna与前额叶kyn或kyna以及血清kyna和纹状体3-hk之间存在显着相关性（图s9a-g和表s3）。其次，我们比较了色氨酸代谢途径中限速酶在scz小鼠和hc小鼠皮质的表达。我们发现，与hc小鼠相比，scz小鼠在三个脑区的kat2 mrna转录增加，海马区的tph1 mrna转录增加（图3f，g），而ido1、tdo2、kat1、kat3、kat4和kmo的表达无显著变化（图10a-f）。为了进一步确定肠道菌群对中枢kyn代谢的影响是否直接，我们评估了clfs对器官型皮质切片培养物中色氨酸–kyn– kyna代谢途径和神经递质水平的影响。在来自scz，hc或spf小鼠的clf存在下，将小鼠前脑皮质切片与腹侧被盖区/黑质体（vta / sn）复合体离体共培养。与来自spf或hc小鼠的clf相比，来自scz小鼠的clf显著促进了kat2表达和kyna合成，但降低了脑切片中的3-hk水平（图3h-j）。此外，scz小鼠的clfs上调了这些脑片中的基础da水平（图3k），而clfs对脑片中kmo的表达没有显著影响（图s10g）。有趣的是，kat-ii酶抑制剂pf-04859989显著抑制scz小鼠clfs对kyna和da浓度的调节作用，因为它显著降低scz-clfs处理的切片中kyna和da的浓度（图3i，k），然而，pf-04859989对scz-clfs诱导的脑切片中3-hk的减少没有显著影响（图3j）。
图3 scz患者的肠道菌群干扰了中枢色氨酸的代谢和神经递质
● scz小鼠的肠道微生物改变及其与行为和神经递质改变的关系
为了鉴定导致scz小鼠中这些神经化学物质和行为改变的微生物，我们对来自scz和hc小鼠的54份粪便样本以及人类供体（患者和对照）的粪便样本进行了宏基因组测序。除去低质量序列和小鼠序列后，每只小鼠平均获得了7.49 gb的人源细菌基因组测序数据（表s4）。种水平上的分类学组成以宏基因组操作分类单位（motu）为特征。种水平的motu的pcoa证实了scz和hc小鼠之间群落明显分离（图4a）。在供体粪便中存在的261个 motu中，受体小鼠的肠内存在112 个motu，scz和hc小鼠之间有55个 motu相对丰度有显著差异（图4b和表s5）。在这些差异富集的motu中，最终确定了30个motu，包括parabacteroides distasonis、parabacteroides merdae、bacteroides eggerthii、odoribacter splanchnicus、fusobacterium ulcerans、odoribacter splanchnicus、clostridium scindens、sutterella wadsworthensis等（图4c）。来自差异富集的motu的功能基因被注释到kegg数据库中， 78个kegg模块在两组小鼠之间的相对丰度上有显著变化（图4d和表s6）。
图4 移植了scz患者粪便的受体小鼠肠道微生物组和功能改变
有趣的是，色氨酸的生物合成功能在hc小鼠的粪便微生物组中显著丰富，这与scz小鼠中色氨酸水平的降低相一致。此外，两组小鼠之间大多数差异富集的motu均与色氨酸或其代谢产物，或大脑和血清中的神经递质显著相关（图5），突出了肠道细菌对大脑色氨酸代谢和神经化学物质的调节作用。
图5 scz小鼠中富集或减少的motu与脑中色氨酸及其代谢产物和神经递质的关联
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