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发稿时间：2020-04-10来源：天昊生物

英文题目: growth effects of n-acylethanolamines on gut bacteria reflect altered bacterial abundances in inflammatory bowel disease

中文题目：n-酰基乙醇胺对肠道细菌的生长作用反映了炎症性肠病中细菌丰度的变化

期刊名：nature microbiology

影响因子：14.3

发表时间：2020年

单位: broad institute of mit and harvard

研究摘要:

炎症性肠病（ibd）与肠道微生物丰度和肠腔代谢产物浓度的变化有关，但是在健康和疾病中特定代谢产物对肠道菌群的影响仍然未知。在这里，我们分析了ibd中丰度差异的代谢产物对ibd中丰度也存在差异的肠道细菌生长和生理的影响。我们发现n-酰基乙醇胺（naes），一类内源性产生的信号性脂质，它在ibd患者和结肠炎t细胞转移模型的粪便中富集，并且它能刺激ibd患者中富集的菌种的生长，并抑制了ibd患者中减少的菌种的生长。使用宏基因组测序，我们概述了naes在离体的微生物群落中的作用，在naes存在的情况下，变形杆菌大量繁殖，拟杆菌减少。对相同微生物群落的宏转录组学分析确定了呼吸链的组成部分对naes的代谢很重要，并且利用呼吸道复合体i缺失突变体进行了验证。在这项研究中，我们确定了naes是一类在ibd患者中富集的代谢产物，其具有将肠道菌群向类似ibd组成转化的潜力。

研究背景:

炎症性肠病（ibd），包括溃疡性结肠炎（uc）和克罗恩病（cd），是由遗传易感性以及肠道微生物与宿主免疫之间的相互作用所引起的慢性胃肠道炎症。目前许多研究集中在ibd期间的微生物和功能改变上，然而，肠道代谢组（包括饮食，宿主和微生物衍生的代谢产物）对肠道健康同样重要。

某些肠道细菌将膳食纤维代谢成短链脂肪酸（如丁酸），从而滋养结肠细胞，促进调节性t细胞扩增并具有免疫抑制功能，而ibd患者中的丁酸盐浓度和产丁酸盐的细菌则大大降低。正常情况下，其它细菌（例如，乳杆菌属，拟杆菌属和梭状芽孢杆菌）将色氨酸转化为吲哚衍生物，可促进健康的肠屏障功能和免疫耐受，然而ibd患者肠中吲哚产生菌也枯竭。尿素酶活性促使微生物组向ibd患者常见的失衡状态转移，并在鼠结肠炎模型中使疾病恶化。寄主来源的代谢产物同样会影响微生物群的组成：ibd患者肠道富集的胆汁酸，能促进胆汁酸代谢相关细菌的繁殖并抑制胆汁敏感细菌的生长。

最近的两项研究结合了宏基因组学和非靶向代谢组学分析，以确定粪便中细菌物种与代谢物之间的联系。第一个是在mgh（prism）队列中针对溃疡性结肠炎（uc）患者，克罗恩病（cd）患者和非ibd受试者的横断面研究；第二个是人类微生物组计划（ihmp）。两者均得出结论，与ibd相关的微生物变化，例如包括变形杆菌在内的兼性厌氧菌的大量繁殖，都伴随着代谢物组成的显著变化。

在本研究，我们调查了ibd患者中差异变化的肠道代谢产物对ibd患者中同样差异变化的肠道细菌生长的影响，发现包括胺和脂肪酸在内的代谢产物强烈影响细菌的生长。亚油酸乙醇胺（lea），一种nae，可以影响ibd患者细菌丰度的变化。结果显示lea和三种与结构相关的nae（棕榈酰乙醇酰胺（pea），油酰乙醇酰胺（oea）和花生四烯酰乙醇酰胺（aea））都在ibd患者和结肠炎t细胞转移鼠模型的粪便中得到富集。这些nae具有共同的受体，并且是内源性大麻素系统的一部分。本研究用这些naes处理了在ibd中改变的细菌的纯培养物，证明了nae促进了ibd中富集的菌种的生长，并限制了那些在ibd中减少的菌种的生长。来源于健康受试者和nae处理的体外细菌群落的宏基因组测序显示，其物种变化与ibd患者体内观察到的物种丰度变化趋势类似。对这些群落的转录组分析表明，响应nae，肠杆菌科中呼吸电子转运链成分的表达增加。这些离体结果暗示了与ibd相关的微生物群落改变与宿主内源性大麻素系统的上调有关。

研究结果：

肠道代谢物影响肠道细菌的生长

先前研究已经针对prism队列受试者的粪便进行了代谢物分析，确定了3829个特征代谢物，其中466个已使用参考标准进行了验证。从这些经过验证的代谢产物中，我们选择了50种代谢物，结果发现ibd和非ibd粪便之间有32个代谢物具有差异。我们使用微量滴定板量化了代谢物对细菌指数期（v max）和稳定生长期（最大od 600 nm）生长的影响（图1a）。

在5种肠道细菌上测试了每种代谢物单一浓度的影响：e. coli、r. gnavus、b. producta、b. fragilis、b. cellulosilyticus。在prism队列中，ibd患者中e. coli, r. gnavus和b. producta更为丰富，而b. cellulosilyticus在ibd患者中则是减少的。尽管b. fragilis在prism队列中差异不大，但由于在其它ibd队列中观察到其与宿主免疫的相互作用较多，同时发现bacteroides在ibd患者中则是减少的，因此我们纳入了b. fragilis。结果发现50％以上的受试代谢产物促进了e. coli, r. gnavus和b. producta的生长，而只有d-鞘氨醇和植物鞘氨醇抑制了它们的生长（图1b）。相反，b. cellulosilyticus只有被少数代谢产物促进生长（18％），而50％以上的代谢产物则抑制了其生长，这其中大部分代谢物在ibd中得到富集。

为了验证单剂量生长效应，在三种菌株上以多种剂量测试了抑制或促进至少一种菌种生长的七种代谢物，这些代谢物包含：胺（lea），甘油磷酸胆碱（c16：0溶血磷脂酰胆碱（lpc）），多元醇（泛酸），脂肪酸（癸二酸和十二烷二酸），甘油脂（2-棕榈酰甘油）和亚油酰基（亚麻酸）。多剂量分析证实lea抑制b. fragilis生长，并且不影响e. coli的生长，而r. gnavus仅在最高lea浓度时才延迟其迟滞期。b. fragilis生长不受单剂量的癸二酸和十二烷二酸的影响，但在多剂量试验中可明显增强；癸二酸和十二烷二酸对e. coli的生长有中等程度的抑制作用。在较高剂量下，亚麻酸延迟了b. fragilis, r. gnavus 和 e. coli的指数生长，同时增强了b. fragilis的稳定生长期生长。这些结果突出了测试一定剂量范围的代谢物对细菌生长的重要性，以评估代谢物作用的全部程度。

图1粪便代谢产物对细菌指数期（v max）和稳定生长期（最大od 600 nm）生长的影响

naes在ibd患者和鼠结肠炎模型的粪便中富集

在ibd患者中富集的lea，可以抑制b. cellulosilyticus的生长，可以促进e. coli, r. gnavus和b. producta生长（图1b，c），这与ibd中这些细菌类群的丰度变化相一致。接着我们确定了ibd患者中富集的另外三种nae：pea，oea和aea（图2a）。我们使用先前验证pea，oea和lea的lc-ms方法，确认了prism受试者粪便中存在aea。虽然pea，oea和lea仅在克罗恩病（cd）样品中富集，但aea在cd和uc中都富集。

我们在独立ibd队列中检测了nae丰度，结果发现，与非ibd样品相比，微生物差异最显著的cd / uc样品中的nae含量最高（图2b），这支持nae与ibd中微生物组成改变之间的联系。由于所使用的lc-ms方法不能产生绝对浓度，因此我们通过对prism队列样本中的nae进行定量分析，进一步证实了ibd患者粪便中nae升高（图2c）。

为了研究相关动物模型在炎症过程中naes是否升高，我们测量了从rag2-/-小鼠收集的粪便中的nae浓度（在诱发结肠炎之前和之后）。因为rag2-/-小鼠无法产生成熟的b和t淋巴细胞，所以将天然t细胞从野生型供体小鼠转移到rag2-/-小鼠中，从而诱发结肠炎。在无特定病原体（spf）的条件下饲养了rag2-/-小鼠，并在第0周（将天然t细胞转移到rag2-/-小鼠之前）收集了粪便，然后转移了从野生型小鼠获得的t细胞，六周后，结肠炎在接受t细胞转移的rag2-/-小鼠中发生，但在未接受t细胞转移的rag2-/-小鼠中未发生。相对于t细胞转移前同一小鼠（第0周）或者没有接受t细胞转移的小鼠，在t细胞转移六周后收集的粪便中检测到所有四种nae的浓度得到增加，并与患者发现的浓度相似（图2d）。

我们还对这些样品进行了宏基因组测序，以鉴定与nae丰度相关的细菌分类群。在与prism样品中发现的共有的物种中，我们观察到患有结肠炎的小鼠具有相同的丰度趋势：t细胞转移后，akkermansia, alistipes和eubacterium丰度减少，而enterococcus丰度增加。因此， nae丰度的增加和相应的细菌群落变化都是小鼠和人类结肠炎的特征。

图2  在ibd患者和结肠炎小鼠模型中，nae升高

naes促进了ibd患者中富集的物种的生长，并抑制了ibd患者中减少的物种的生长

为了评估对prism队列差异物种的生长效应，以两种剂量在11种菌株上测试了4种nae：最初的筛选中使用的3种参考菌株；ibd患者富集的1种参考菌株（lactobacillus gasseri）；从人粪便中分离出的7种菌株（ibd中的3个富集菌种，3个减少菌种和1个不变的菌种）。从剂量生长曲线推导出v max和最大od 600 nm，绘制成nae浓度的函数以确定其生长效应（图3a，b）。nae处理后，所有测试的ibd患者富集的物种的生长均得到增强，而ibd患者减少的物种的生长则受到抑制。加入oea和lea可使生长增强最强，而lea和aea的抑制作用最强，pea对增长的影响很小。

prism队列的宏基因组和代谢组学分析相结合，使我们能够认识到ibd中差异丰富的细菌物种和代谢物之间的潜在机制联系（图3c）。当将人类协变量数据与我们的体外生长分析进行比较时，如关联模型所预测的一样，大多数菌株都对nae有反应（图3b与图3c）。

为了解释调控细菌对nae应答的分子机制，解析了lea和aea（其抑制作用最强）处理的b. fragilis的转录组数据（图3b）。选择b. fragilis是因为它是一个经过充分研究的物种，属于经常在ibd中减少的菌。在lea和aea处理b. fragilis中，最上调的基因编码在外排转运中起作用的膜相关蛋白，表明所有上调的外排转运基因可能在将nae和其它脂肪酰胺主动泵出细胞或细胞质的途径中发挥作用；下调最严重的基因编码一种外膜蛋白，与e. coli fadl (bf9343_1322)同源，后者是一种长链脂肪酸（lcfa）的导入者。在lcfa代谢中同样重要的是，电子通过转移性黄素蛋白从脱氢酶转移到膜结合的呼吸链上，响应lea和aea，两个电子转移黄素蛋白亚基（bf9343_3116和bf9343_3117）均下调。这些数据表明b. fragilis i可抑制nae的转运和代谢，同时促进其外排。

图3  naes对细菌生长的影响

naes使离体肠道群落向类似ibd组成转变

为了确定在单培养细菌中观察到的nae的生长效应是否在细菌群落中可以得到重复，我们在两个化学恒温器（a和b）中均接种了来自不同健康人供体的粪便，将样品分别与四个nae分开处理，然后混合（表示为nae-mix），同时二甲基亚砜（dmso）处理作为对照。我们收集了处理前和处理后1、4、8、12和24小时的样本，以进行宏基因组和宏转录组测序。分析测序的物种组成，我们在处理前鉴定出66种（化学恒温器a）和85种（化学恒温器b）。在两个化学恒温器中均发现了单培养时的细菌：e. coli, alistipes shahii和s. salivarius；在化学恒温器b中检测到了chemostats.b. fragilis和b. producta。

在恒化器a中， 12小时后最极端的影响出现在aea中，几乎完全被enterobacteriaceae所取代（图4a）。lea和nae混合处理的趋势相似。oea处理不影响enterobacteriaceae的丰度，但增加了enterococcaceae和streptococcaceae的相对丰度，而降低了bacteroidaceae和rikenellaceae的相对丰度（图4b）。

除pea外，所有naes处理后的alistipes和bacteroides的丰度均降低（图4c），这与单培养观察结果（图3b）以及在prism 和ihmp ibd受试者中的bacteroidetes减少一致。在prism ibd受试者中，肠杆菌barnesiella intestinihominis受到抑制，其在体外群落中也被aea，lea和nae-mix抑制。在物种水平上，b. producta和clostridium clostridioforme的丰度随着aea，lea和nae-mix处理增加，而这两种物种在prism ibd受试者中均富集。在相同条件下，klebsiella pneumoniae和proteus mirabilis也增加，而ihmp ibd受试者中klebsiella pneumoniae也明显富集，此外这两个物种在小鼠模型中与结肠炎发生有关。这些结果都表明lea，aea和nae的组合足以将离体微生物群落从健康群落转变为类似ibd患者的群落组成。

图4 naes对体外微生物群落组成的影响

转录变化突出了对nae的抗氧化响应

响应nae处理，微生物群落中转录活性同时也发生变化（图5）。kegg模块的显著变化包括氨基酸，辅因子，维生素，碳水化合物，聚糖和脂质代谢功能。在aea的存在下，柠檬酸盐循环的厌氧，还原性（m00150）和氧化性（m00010）分支均被上调，这是由肠杆菌科enterobacteriaceae驱动的。naes处理后伴随能量代谢增加的是呼吸电子转运链的上调。鉴于复合物i（m00144）是有氧条件下大肠杆菌中的oa代谢所必需的，我们测试了复合物i对厌氧条件下nae代谢是否重要。我们在oa，oea或lea的存在下培养了野生型和复合物i缺陷型（δnuob）大肠杆菌菌株，结果发现与野生型不同，oa或nae不会促进δnuob突变体的生长，这突出了功能性呼吸链对nae代谢的必要性。在aea和lea的存在下，泛醌也得到增强，泛醌是大肠杆菌中与膜相关的辅酶，可将电子从复合物i转移到最终电子受体，在有氧条件下，泛醌可防止脂肪酸代谢产生的氧化应激，这些结果表明，其功能对于厌氧条件下的nae代谢同样重要。

假设乙醇胺基团裂解后naes像lcfas一样代谢，我们研究了厌氧条件下在大肠杆菌中运行的好氧β-氧化模块（m00086）和ko（k12507，k01782和k00626）。在恒化器群落中，厌氧脂肪酸降解功能保持不变，m00086对oa和naes的反应受到抑制，这表明感兴趣的途径未充分测量，或者其它脂肪酸降解机理在厌氧条件下起作用。另外，响应于aea，lea和nae-mix，涉及乙醇胺利用的微生物群落功能（k04024和k04027）被上调，表明nae分解。两个恒化器组合的联合转录组分析强调了呼吸链对肠杆菌科nae新陈代谢的必要性。

图5  响应nae处理，微生物群落中转录活性的变化