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发稿时间：2020-03-18来源：天昊基因

背景介绍

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，sma）是一种源于脊髓前角退变引起肌无力和肌萎缩的神经系统遗传性疾病，属常染色体隐性遗传病。活产婴儿的发病率为i／6000～i／10 000，人群携带者频率为1／40～1／50，居儿童致死性常染色体遗传病的第2位。

根据发病年龄和进程将sma分为四种类型：婴儿型（sma i型），中间型（sma ii型），少年型（sma iii型）和成年型（sma iv型）。四种类型sma基因位点均在5号染色体上。运动神经元存活基因1（smn1）的外显子纯合缺失（90-95%）或smn1缺失/点突变（或部分缺失）（3~5%）的复合杂合突变是导致该疾病发生的主要原因。 smn1: c.22dupa是中国人群报道频率最高的点突变，在sma病人中其频率近1%。运动神经元存活基因2（smn2）基因会转录产生10-20%全长有功能的转录本，因此在sma病人中，smn2基因拷贝数与临床表型严重程度密切相关，smn2仅1拷贝96%可能是sma i型，而smn2>=4拷贝~90%可能是sma iii/iv型。有研究报道,在sma病人中，smn基因下游的神经元凋亡抑制蛋白基因(naip)的缺失可能与更严重临床表型相关。因此，基因检测是确诊sma的金标准。      

产品介绍

用于人smn1/smn2基因拷贝数检测。该检测体系共设计16对探针，通过采集人基因组dna，应用公司自主研发且具有自主知识产权的accucopy^®多重荧光竞争性pcr （授权专利号：zl201010180551.2，du et al, 2012）与等位基因特异性荧光pcr技术组合，用于smn1及smn2基因的拷贝数检测， 也可以检测人基因组dna中是否存在smn1: c.22dupa突变以及naip基因的拷贝数，同时对smn1基因可能存在部分外显子（如e1-e4, e6-e8) 缺失给出提示。该检测产品主要的开展领域为妇产科，作为sma的携带者筛查对所有备孕期或孕早期的夫妇进行普筛，以及sma携带者的优生优育指导和产前诊断，还可在神经科用于sma的确诊、辅助判断sma的严重程度。

检测内容：

检测smn1、smn2的拷贝数，并可对中国人高频点突变smn1 c.22dupa以及naip基因的拷贝数，及smn1、smn2的融合基因进行检测，并可对smn1基因可能存在部分外显子（如e1-e4, e6-e8) 缺失给出提示

产品优势

1、超高精准检测：采用天昊诊断公司自主研发且具有自主知识产权的拷贝数检测技术accucopy®多重荧光竞争性pcr进行检测，平均检测cv<5%；

2、检测范围广：可对smn1及smn2 8拷贝内的变异进行准确检测，还可对中国人高频点突变smn1 c.22dupa以及naip基因的拷贝数，及smn1、smn2的融合基因进行检测，并可对smn1基因可能存在部分外显子（如e1-e4, e6-e8) 缺失给出提示；

3、疾病判断更精确： 加入smn2、naip拷贝数检测，更有利于辅助判断sma的严重程度；

4、使用范围广：可用于正常人群的sma携带者筛查及sma患者的基因诊断；

5、高效快速： 5小时之内完成实验，软件自动精准判读结果；

技术原理：

通过取一定量的竞争性dna片段混合物（每个竞争性dna片段与各自对应基因片段通常仅有2-3bp差别），然后与合适量的检测样本dna混合，随后利用多重荧光pcr引物对检测样本dna及竞争性dna片段混合物进行参照基因片段和目标基因片段的扩增；多重pcr产物经荧光毛细管电泳后根据扩增长度差异进行分离，获取不同基因片段的检测样本峰（s）以及竞争性dna峰（c）的峰高值；分析每个基因片段的s/c峰高比值（称r值），然后将目标基因r值除以参照基因r值获得rr值(用于校正不同检测样本dna用量差异)，通过将检测样本的rr值除以参照样本的rr值（用于校正不同基因片段对应竞争性dna的用量差异）后再乘以参照样本在该目标基因上的拷贝数即可获得目标基因的精确拷贝数。

 

技术对比：

检测技术	位点数	检测时间	部分缺失	操作	准确性	样本要求	结果判读
qpcr	单反应、单位点，单参照，位点之间不能相互校正，不能检测更多的点突变和部分缺失	3小时	无法检测	复杂（涉及到多次重复实验，否则假阳性率高）	低（无重复，假阳性、假阴性率较高，特别是对于携带者筛查；重复反应，其cv约15-20%）	正常抽提样本	标准化判读
mlpa	多重位点，含多个参照位点，位点设计没有针对国人突变的热点	24小时	可以检测	复杂（实验操作繁琐，每次需至少5个对照）	中（一个经典技术，平均cv保持在10%-20%）	样本质量要求高，同批次检测样本需相同试剂同批次抽提	软件判读，需要经验
accucopy	多重位点，含3-4个参照位点；位点之间相互校正，有望新增10个突变位点	4小时	可以检测	简单（每次只需对照dna及阴性对照各1个）	高（自主专利技术，位点之间相互校正，平均cv<5%）	正常抽提样本	软件自动化判读，柱形图使结果更加直观

检测流程

 

检测效果

应用accucopy^®多重荧光竞争性pcr与等位基因特异性荧光pcr技术检测

 

正常样本   smn1=2   smn2=2   naip=2

 

sma携带者样本   smn1=1   smn2=3   naip=1

 

sma携带者样本   smn1=1   smn2=1   naip=2

 

sma患者样本   smn1=0   smn2=3   naip=1

 

sma患者样本   smn1=0   smn2=2   naip=1

 

sma患者样本 smn1=0   smn2=4   naip=1

 

参考文献

1. du r, lu c et al., efficient typing of copy number variations in a segmental duplication-mediated rearrangement hotspot using multiplex competitive amplification. j hum genet. 2012. 57(8):545-51

2. ding q，wu x, et al., accucopy quantification combined with pre-amplification of long-distance pcr for fast analysis of intron 22 inversion in haemophilia a. clin chim acta. 2016 458:78-83.

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