浙江大学环境与资源学院近期在环境科学与生态学top期刊《environmental pollution》上发表了关于沸石-纳米零价铁复合材料对农田土壤中镉、铅、砷的固定化：封存机制与微生物响应的研究文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的相对定量扩增子测序工作。在恭喜客户发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目：zeolite-supported nanoscale zero-valent iron for immobilization of cadmium, lead, and arsenic in farmland soils: encapsulation mechanisms and indigenous microbial responses
中文题目：沸石-纳米零价铁复合材料对农田土壤中镉、铅、砷的固定化：封存机制与微生物响应
期刊名：environmental pollution
5年平均影响因子：6.1
研究概要：
沸石-纳米零价铁复合材料（z-nzvi）具有很大的金属去除潜力，但其在实际土壤系统中的包埋机理和生态风险尚不完全清楚。我们进行了长期培养实验，以期对自然污染农田土壤中金属（镉、铅、砷）与z-nzvi之间的相互作用以及土壤修复过程中土著细菌群落的变化有新的认识。具有ph调节和吸附能力，30g kg -1 z-nzvi能显著降低了土壤有效金属浓度10.2-96.8%，180d后在酸性和碱性土壤中转化为强结合组分。对土壤中的z-nzvi进行了创新性的磁选，并进行了xrd和xps表征，结果表明，b型三元络合物、非均相共沉淀和/或同时发生的金属氧化还原反应，特别是cd3（aso4）2、pbfe 2（aso 4）2（oh）2和as0的形成，仅在特定土壤条件下发生。16s扩增子测序表明，添加z-nzvi后，耐铁/敏感细菌、ph敏感细菌、反硝化细菌和耐金属细菌的暂时变化最终被消除，因为土壤特性推动了本土细菌群落的重建。同时，z-nzvi恢复了土壤细菌dna复制和反硝化功能的基本活性。这些结果证实了z-nzvi在无明显生态毒性的情况下，对重金属污染农田土壤的长期修复具有一定潜在应用价值。
研究背景：
随着工业化和现代化进程的加快，世界范围内的农业土壤金属污染日趋严重。在不同的人为来源中，采矿和冶炼通常是主要来源。控制优先的共存污染物as、cd、pb在污染农田土壤中的生物有效性和迁移率均显著高于其它金属。金属在土壤-作物系统中迁移转化后，通过食物链进行生物放大，对人体造成内脏损伤和免疫系统疾病等健康风险。因此开发修复技术降低污染区金属的毒性成为研究热点。
鉴于其成本效益，土壤改良剂包括生物炭、氧化铁、粘土矿物和钙质材料已广泛用于原位固定和转化不稳定金属为固体。石灰对土壤中cd、pb有很好的吸附能力，但随着土壤ph值的增加，石灰对as的迁移有促进作用，而fe（iii）-生物炭对as污染土壤的吸附则会导致土壤酸化作用而活化cd。因此，筛选合适的改良剂对于在不增加额外风险的情况下修复金属污染的农田土壤至关重要。
由于纳米零价铁（nzvi）及其复合材料具有低成本、高活性的特点，在以阳离子金属和阴离子类金属共存为目标的情况下，它们被优先使用。nzvi具有独特的核壳结构，可以分别通过零价铁心和氢氧化铁壳作为电子供体和吸附剂。由于nzvi颗粒进入环境后会立即聚集，因此提出了用天然沸石等环保基质分散nzvi的方法。天然沸石具有多个阳离子结合位点和介孔结构，可以减少裸nzvi的聚集，提高其修复效率。然而，目前的研究主要集中在沸石负载的nzvi（z-nzvi）对地下水的净化，而忽略了土壤中天然金属的污染。同时，许多研究揭示了z-nzvi与金属离子之间的相互作用，但在不同土壤条件下（如ph值）的具体反应过程却很少被探索。由于缺乏实用的分离技术，改性剂与土壤污染物反应后的表征受到限制。幸运的是，从土壤中磁选出的z-nzvi复合材料可以用来研究固定化污染物的价态和矿物相。因此，可以逐一确定可能的机制。z-nzvi一旦被引入土壤，必然会影响土壤生态系统中本地微生物的活性和行为。在相同的nzvi浓度下，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌具有更强的耐药性，这是由于前者细胞壁较硬。通过盆栽试验，有研究证实nzvi引起的氧化胁迫可抑制金属污染土壤中丛枝菌根真菌的发育和功能。将裸露的或包被的nzvi与铁还原、铁氧化和反硝化过程耦合，可以促进某些功能菌（如shewanella、sediminibacterium和bacteroides）的生长。因此，有必要评估z-nzvi对本地微生物的长期影响，以填补其在土壤生态系统中应用风险研究方面的空白。
本研究的假设是，长期施用z-nzvi可通过多组分络合和共沉淀同时固定酸性和碱性农田土壤中的as、cd和pb，且无明显的生态风险。采用创新的磁选设计，结合显微光谱法和分子生物学技术，为土壤修复过程中次生矿物z-nzvi及其相关微生物反应提供重要信息。本研究的目的是：（1）合成z-nzvi复合材料并确定其在酸性和碱性土壤中固定金属的持久性；（2）表征原始和分离的z-nzvi的表面组分，阐述其封存机制；（3） 诊断改良剂对本地细菌群落和功能基因表达的影响（例如反硝化和生物活性基因）；（4）评估z-nzvi在土壤修复中的综合环境效益。
研究方法：
土壤取样和预处理：
从我国南方和北方采集了两种ph值在5.12～7.93之间的重金属污染农田土壤。酸性和碱性土壤采样点分别位于河南省上虞市和济源市铅锌矿区及有色冶炼厂周围。这些土壤中的总砷、镉和铅含量严重超过中国农用地二级标准（nepa，2018）
改良剂准备：
所有化学品和试剂均为试剂级，所有溶液均用超纯水配制。采用液相还原法合成了z-nzvi复合材料，简单地说，沸石粉（48.0 g）和400 毫升 0.240m六水三氯化铁溶液混合，在2升三颈烧瓶中加入400毫升0.960m硼氢化钠溶液，在好氧条件下连续还原。机械搅拌1小时后，用磁铁从混合物溶液中分离出z-nzvi复合材料，用超纯水洗涤三次去除可溶性杂质，然后在60℃真空干燥。复合材料中nzvi的含量约为10.0%（w/w）。
土培实验设计：
根据先前的研究，0、10和30 g kg-1沸石和z-nzvi在装入塑料罐之前，与酸性和碱性土壤充分混合。5个处理如下：对照组（ck）；10 g kg-1或30g kg-1个沸石处理（z1、z3）；10 g kg-1或30 g kg-1 z-nzvi处理（n1，n3）。三次重复，每次处理1.50kg的样品恒定含水量70.0%（25度）。这些罐子上覆盖着多孔塑料薄膜，以确保通风和减少水分损失。培养1、3、7、15、30、60、120和180d后，从每个培养罐中采集100g亚样本，其中90.0g用于理化分析，10.0g用于生物信息学分析。
改良土壤分析：
新鲜亚样本经冻干、筛分后进行理化分析。用相应的电极分别测定了1:2.5（w/v）和1:5（w/v）土壤水悬浮液的ph值和电导率。以1:5（w/v）的土水比用去离子水提取溶解有机碳（doc），然后过滤用于总有机碳分析。用0.100m cacl2萃取土壤有效态cd、pb和fe，用0.500m nahco 3萃取土壤有效态as。采用bcr顺序萃取法，研究了亚样品中as、cd和pb的组分，包括酸溶组分、还原组分、氧化组分和残留组分。另外，还分别提取了金属的水溶性部分。所有提取物均经0.45微米膜过滤，并采用电感耦合等离子体质谱进行分析。
磁分离与改性剂的表征：
从30 g kg-1 z-nzvi处理罐中分别在30和120天取50.0g亚样，冷冻干燥和磁性分离。将分离出的磁性材料研磨（<0.16mm）并再次进行磁性分离，以确保z-nzvi的纯度。用x射线衍射仪和x射线光电子能谱仪对z-nzvi合金在使用前后的矿物相组成和原子价态进行了表征。利用扫描电子显微镜结合能量色散x射线和傅里叶变换红外光谱分析了改性剂表面的微观形貌、元素含量和官能团。
16s扩增子测序和实时定量pcr：
采用16s扩增子测序和实时定量pcr（rt -qpcr）技术，研究了亚样本中本地细菌群落结构和功能基因表达。
部分研究结果：
本土细菌群落的反应
在门和属水平上观察到细菌的相对丰度，以显示在土壤修复过程中修复对本地细菌群落的影响（图7）。尽管添加z-nzvi（1-15 d）后，酸性和碱性土壤中的细菌群落结构发生了显著变化，在10或30 g kg-1 z-nzvi处理下，群落shannon-wiener多样性指数略有增加或减少(p > 0.05)（图s8），排除了z-nzvi在好氧培养期间由于无毒氧化产物（feooh/fe2o3）和金属去除而产生的广谱生态毒性。
在对照组（图7a和b）中，占门水平细菌群落总丰度72.5%以上的优势菌门（包括firmicutes、proteobacteria、acidobacteria、actinobacteria、gemmatimonadetes）的相对丰度在短期暴露于z-nzvi后发生了明显变化。在经z-nzvi处理的土壤中，属于firmicutes的优势属bacillus、paenibacillus、alicyclobacillus的相对丰度显著增加（图7c和d），这是由于它们的抗铁性和土壤ph值的增加。已有研究证明bacillus促进了铁（iii）还原，并在nzvi层周围富集，可将铁和金属重新分配到更稳定的铁矿物相中。然而z-nzvi对革兰氏阴性菌xanthomonadaceae、massilia、lysobacter（隶属于proteobacteria）的生长有抑制作用，因为它们的细胞壁没有肽聚糖层。在酸性条件下，酸杆菌属acidobacteria的acidipila、gp14、gp6和gp4都受到ph调节剂的抑制，并且共生属（subdivision 3）在碱性土壤中的相对丰度降低（图7d）。相比之下，放线菌门actinobacteria的gaiella，arthrobacter以及芽单胞菌门gemmatimonadetes的gemmatimonas被鉴定为铁氧化和反硝化细菌，其生长刺激得益于电子供体z-nzvi在两种土壤中的作用。这些生物电子受体可以加速fe0的氧化，影响z-nzvi在金属固定化中的效率，无论是正的还是负的。
图7 金属污染的酸性和碱性土壤中的细菌群落结构（a-b）（门）和（c-d）（属）
随着fe（iii）的再固定化，细菌群落的主成分分析（pca）展现了时间尺度上的相似样本簇，因此，z-nzvi的干扰最终被消除（180 d）（图s9）。
图s9 细菌群落间差异的主成分分析（pca）
与酸性土壤相比，碱性土壤由于z-nzvi对其理化性质的干扰较小，细菌群落间的系统发育差异较小。环境因子与优势属丰度（>1.00%）之间的皮尔逊相关分析如热图（图8）所示。ph、ec和doc作为土壤的主要理化性质，决定着土壤中污染物和养分的有效性和迁移性，因此它们与大多数优势属有着密切的相互作用（p<0.05）。只有sphingomonas、lysobacter、terrimonas等携带金属抗性基因的特定属分别与有效pb、cd、as浓度呈显著正相关（p<0.05），因此在金属固定化后，由于失去了生存优势，它们的相对丰度降低。结合冗余分析（图s10），发现z-nzvi对ph、ec和doc的影响，而不是金属（loid）的可用性，是重建本地细菌群落的关键驱动因素。
图8 优势属丰度（>1.00%）与环境因子的pearson相关分析的热图（p<0.05；**p<0.01）。
图s10 环境因子对本地细菌群落影响的冗余分析：（a）酸性土壤；（b）碱性土壤。
功能基因的反应
基于rt-qpcr分析，通过比较处理组和对照组，计算功能基因（gyra、narg和nirs）的相对表达水平（图s11）。由于z-nzvi通过降低金属的有效性改善了细菌的栖息地，因此gyra基因（编码dna回旋酶）在酸性和碱性土壤中的相对表达水平增加了约10.3倍和19.7倍，这与刺激所有细菌的dna复制相对应（图s11a-b）。在添加z-nzvi的酸性和碱性土壤中，narg和nirs基因（编码硝酸盐和亚硝酸盐还原酶）的相对表达水平增加了2.14-3.54和5.63-6.18倍（图s11c-f），这是因为由于碱性土壤中的反硝化细菌（包括gemmaticonas、arthrobacter和gaiella）的细菌丰度（9.55%）高于酸性土壤（2.10%）。此外，z-nzvi对反硝化过程的促进作用在酸性土壤中比在碱性土壤中持续时间短，因为酸性条件加速了nzvi的氧化和电子转移。因此，长期施用z-nzvi可以改善土壤质量，恢复当地细菌的某些生态功能。
图s11 rt-qpcr测定酸性土壤（a，c，e）和碱性土壤（b，d，f）中功能基因表达（gyra，narg和nirs）。
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