南京农业大学凌宁老师课题组近期在《soil biology and biochemistry》上发表了长期施加有机物料如何增加土壤磷酸酶活性：针对phod和phoc功能性微生物种群的研究文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了针对phod和phoc功能性微生物种群的扩增子测序工作。在恭喜客户又发表高分文章的同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目：understanding how long-term organic amendments increase soil phosphatase activities: insight into phod- and phoc-harboring functional microbial populations
中文题目：了解长期施加有机物料如何增加土壤磷酸酶活性：针对phod和phoc功能性微生物种群的研究
期刊名：soil biology and biochemistry
影响因子： 5.29
研究概要：
在使用有机材料作为矿物肥料替代品的背景下，了解有机物料如何影响土壤细胞外磷酸酶活性是非常重要的，这是因为磷酸酶活性能加速有机磷（p）的矿化。为了解决这一问题，本研究从微生物介导途径的角度研究了有机物料对土壤酸性（acp）和碱性（alp）磷酸酶活性的影响，以及有机物料如何影响这些活性。本文对来自世界各地106项已发表研究的599项测量数据进行了meta分析，基于meta分析，有机物料与纯矿物施肥相比，平均细胞外acp和alp活性分别提高了22%和53%，土壤有机碳（c）、全氮（n）和速效磷（p）含量以及微生物生物量c、n库均显著增加。根据我们一项30年的长期施肥田间试验，发现有机物料土壤中编码alp的phod功能性微生物种群与编码acp的phoc功能性微生物种群关系更为密切，并且通过有机物料处理也确实观察到更多的微生物网络中心。土壤c:p和n:p比值以及微生物生物量c是phoc和phod功能性微生物种群丰度、多样性和群落组成的主要预测因子。我们的工作强调了理解土壤c:n:p化学计量法如何介导磷酸酶功能性微生物种群的重要性，以确定使用有机物料对增加磷酸酶活性的下游后果。
图7 描述c:n:p化学计量学驱动的phod和phoc功能微生物对磷酸酶活性组合效应的概念模式
研究背景：
虽然增加施入农业生态系统的磷（p）肥量暂时维持较高的作物吸收生物可利用磷水平，但在第一个作物种植季节，有效利用的矿物磷仅占施入总量的10-20%，由于金属阳离子的沉淀、有机物池中的滞留或由于淋滤而损失，添加的大部分磷最终不可用。有机材料，如农家肥、稻草或肥料和堆肥的混合物，已被提出作为矿物肥料的替代品。这些管理策略可以通过促进植物的养分供应，同时通过补充有机磷来维持土壤肥力，从而优化未来磷资源的利用。或者，土壤微生物可以利用磷酸化化合物作为碳源，通过胞外酶的产生和活性矿化有机磷。有机磷的矿化是由主要由土壤微生物群产生的土壤磷酸酶的胞外存在催化的，尽管植物也能分泌酸性磷酸酶。目前还没有关于磷酸酶活性如何对有机物料作出反应的共识，据报道，在不同程度上磷酸酶活性既减少又增加。酶的生产在能量和营养上都是昂贵的，需要微生物对c和营养物的投资（称为细胞的经济政策）。由于物种营养需求和经济策略的固有差异，生物体通常对资源可用性作出非随机响应。当地微生物种群与环境的相互作用驱动着土壤生态系统的关键过程，微生物将它们的资源分配给产磷酶，以实现最佳生长。土壤c:n:p化学计量是驱动微生物群落组成的一个重要因素，可以限制生物地球化学循环，因此了解土壤c:n:p化学计量学是如何影响磷酸酶产生菌群和最终磷酸酶活性是至关重要的。在这里，我们对来自世界各地106个已发表研究的599个测量数据进行了meta分析，以比较有机物料和矿物肥料对细胞外酸性磷酸酶（acp）和碱性磷酸酶（alp）活性和土壤c:n:p化学计量学的影响。acp和alp活性被用作评价有机磷矿化为生物可利用无机磷的指标。我们假设有机物料将导致更高的活性，这将与土壤c:n:p化学计量的变化有关。以前的研究已经调查了不同施肥制度下土壤中磷酸酶微生物种群。然而关于群落特征如何影响磷酸酶活性，其最终决定有机添加物对有机磷矿化的影响仍然是未知的。为了详细说明meta分析的结果，并更好地了解有机物料对由acp和alp相关微生物种群介导的磷酸酶途径的影响，我们在江西红壤研究所进行了一项30多年的田间试验，收集了四个施肥制度下的红壤，选择phoc和phod基因分别作为acp和alp的生物标记。我们进一步假设，c:n:p化学计量驱动的phoc和phod功能性微生物种群有助于acp和alp活性的增加，用qpcr和扩增子测序测定了上述两种微生物种群的丰度、多样性和组成。
研究方法：
研究地点和土壤取样：
于1986年在中国江西红壤研究所进行长期施肥试验，该区属典型的亚热带季风气候，年降水量为1537毫米，年蒸发量为1100～1200毫米，年平均气温为17.5℃。试验点自建立以来一直处于玉米-玉米轮作状态。实施了以下四个处理：（1）对照，不施肥；（2）npk，纯矿肥；（3）m，纯有机肥；（4）mnpk，化肥和有机肥配施。所有处理均在3个22 m 2（5.5 m~4 m）的田间复制区进行。试验点自建立以来一直处于玉米-玉米-休耕轮作状态。实施了以下四个处理：（1）对照，不施肥；（2）npk，纯矿物肥料；（3）m，纯有机肥；（4）mnpk，化肥与有机肥联合施用，每一个处理在不同的3个地块有三个生物学重复。2016年收获后采集土壤样本，简单地说，从每个地块收集了四个土芯（直径5cm，深度0-20cm），混合后提供单一样本，用筛子（<5mm）去除可见的植物物质和有机碎屑。每个样品的一部分储存在4℃下，用于土壤理化性质（有机碳soc、总氮tn、有效磷ap）分析、磷酸酶活性（土壤细胞外酸性磷酸酶acp和碱性磷酸酶alp活性）和微生物生物量（微生物生物量c（mbc）和n（mbn））的测定，其余的储存在-20℃提取dna。
qpcr定量：
通过qpcr分析phoc和phod功能性微生物种群中的phod和phoc基因拷贝数。
phoc和phod功能性微生物群落特征:
分别使用引物对alps-f730和phoc-a-f1/phoc-a-r1对phod和phoc基因进行pcr扩增，通过高通量测序，评估含有phod和phoc的微生物群落的多样性和组成。
研究结果：
有机物料对磷酸酶活性的影响
根据对106项已发表研究中599项测量结果的meta分析，有机物料平均使土壤潜在acp和alp活性分别比纯矿物施肥提高了22%和53%。有机物料处理土壤的微生物生物量（mbc，增加了54%；mbn，增加了31%）以及土壤有机c（29%）和养分含量（tn，19%；有效磷，48%）也比纯矿物施肥（图1a）高。所有这些变量和化学计量比都与acp和alp活性有很强的关系（图1b）。
图1 a：有机物料对土壤细胞外磷酸酶活性、微生物生物量库和土壤c:n:p化学计量的平均影响大小；b：该网络显示磷酸酶活性与驱动力（微生物生物量池和土壤c:n:p化学计量）之间的关系，虚线箭头表示贡献系数小于0.2，箭头上方的数字表示样本大小，箭头的厚度表示关系的大小。
在田间施肥试验中，与npk处理相比，有机物料处理（m和mnpk）的土壤潜在acp和alp活性分别提高345-569%和11-44%（图2a和b）。有机物料处理土壤表现出与对照（对照组和npk组）不同的土壤c、n和p含量及其比值、微生物生物量c和n及其比值。有机物料处理土壤有机碳、全氮含量、速效磷含量、微生物量碳、氮含量均高于对照组，支持了meta分析的结果。
有机物料对phoc和phod功能性微生物种群的影响
phod基因丰度的变化与土壤alp活性的变化趋势相似，m处理的丰度最高，mnpk次之（图2c）。不同处理组间的phoc基因丰度没有差异（图2d）。然而，尽管phod多样性保持不变（图2e-f），但不同处理组间phoc功能微生物的多样性存在显著差异。pca分析表明phod和phoc群落的组成有明显的分离。
图2 a-c：潜在碱性磷酸酶（alp）活性，基因拷贝数估计的phod基因丰度，shannon指数估计的phod微生物群落多样性；d-f：潜在酸性磷酸酶（acp）活性、基因拷贝数估计的phoc基因丰度和phoc微生物群落多样性。
构建了一个cladogram来说明phoc或phod编码基因的氨基酸序列与otu丰度（平均相关丰度>0.05%）之间的系统发育关系（图3）。具有高度相似性的氨基酸序列（acp或alp）可能由不同的phod或phoc物种（otus）编码，而任何一个otus也可能编码不同的氨基酸序列（图3）。phod功能微生物的优势菌门是actinobacteria（相对丰度为77-92%）、planctomycetes（4-8%）和firmicutes（2-6%），优势属包括streptomyces, nocardiopsis, micromonospora, bacillus等（图3a）。phoc功能微生物的优势菌门是proteobacteria (58-88%), bacteroidetes (3-19%) , actinobacteria (1-7%)，其中优势菌属有altererythrobacter, pricia, desulfoluna, bosea等（图3b）。
图3 a:cladogram图解了phod氨基酸编码序列与otu丰度（平均相关丰度>0.05%）之间的系统发育关系；b：cladogram图解了phoc氨基酸编码序列与otu丰度（平均相关丰度>0.05%）之间的系统发育关系；分支的颜色代表了基于门水平序列的不同分类，otu的颜色代表了基于属水平序列的不同分类。在对照、npk、m和npk处理中，从内到外的环代表了otu的相对丰度。
phod与phoc功能微生物群落的
根据各处理间土壤理化性质的变化，将处理分为有机（m和mnpk）和非有机物料处理（对照和npk）两组，并利用这两组进行指示物种和网络分析，通过dufrene-legendre分析确定指示物种，以确定与特定处理相关的otus（图4）。
图4 通过dufrene-legendre分析确定的指示物种，用于鉴定与有机物料土壤（m和mnpk）和对照（对照和npk）特别相关的otus。圆圈代表otus，每个圆圈的大小代表它的相对丰度。
利用网络分析确定了phod和phoc功能微生物群落的共生模式，无论采用什么处理，观察到的正相关数目多于负相关数目（图5）。与对照组相比，有机物料处理组中phod微生物与phoc微生物联系更紧密（例如节点和边缘更丰富）（图5）。有机物料处理组观察到19个中心，其中otu141（phoc，xanthomonas）是一个边缘数目比其它都多的关键分类单元。对照组中存在15个活跃的中心，otu7（phoc，xanthomonas）代表一个关键分类单元（图5）。
图5 phod与phoc功能微生物群落的共生网络。有机物料土壤（m和m npk）与对照土壤（对照和npk）之间存在强相关（spearman'sρ>0.6）和显著相关（p<0.05）。蓝色边缘表示两个单独节点之间的正交互，而红色边缘表示负交互。蓝色节点表示属于phod基因的otus，红色节点表示属于phoc基因的otus。具有字的节点是网络中的有效中心（前10个具有高连接性的otu）。
细胞外磷酸酶活性的可靠预测因子
随机森林模型一致认为微生物生物量c在预测phod功能微生物丰度中表现出更高的随机森林mpi（26%），其次是土壤c:p比率（25%）（图6a）。根据随机森林分析，土壤c:p比率（26%）是主要的预测phod功能微生物群落的因子，其次是土壤n:p比率（24%）和微生物生物量的c:n比率（23%）（图6b）。通过进一步确定alp活性最可靠的预测因子，我们发现土壤c:p比显示出最高的mpi（26%），其次是微生物生物量c（25%），以及phod群落的丰度（24%）和组成（23%）（图6c）。
与phod基因相似，土壤c:p和n:p比值以及微生物生物量c也是phoc群落多样性和组成的主要预测因子（图6d和e）。通过进一步确定acp活性最可靠的预测因子，我们还发现土壤c:p比率表现出最高的mpi（25%），其次是phoc群落的多样性（23%）和组成（23%），以及微生物生物量的c:n比率（23%）（图6f）。
图6 随机森林分析确定磷酸酶（alp和acp）活性和phod和phoc微生物丰度、多样性和群落组成的主要预测因子。
往期相关微生物功能基因测序项目文章链接：
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