为什么要进行单细胞基因表达分析?
跳出传统的基因表达分析,逐个细胞地表征细胞群体,细胞类型和细胞状态等信息
过去,各种生物体、组织和疾病状态中的基因表达差异已经可以利用多种方法来鉴定,比如芯片和大量细胞的rna测序(rna-seq)。这些方法通常需要数百至数百万个细胞作为起始材料,但是只能得到整个细胞群体的平均信息。发育生物学、癌症、神经科学、免疫学和传染病中的复杂生物学过程往往涉及到多个单细胞,它们具有不同的细胞命运、状态和功能。对于这些动态的细胞事件,大量细胞的检测只能提供有限的信息,因为单个细胞的信息已经淹没在其中(griffiths j.a. et al, mol syst biol, 2018)(图1)。
最近,单细胞转录组技术,包括我们的高通量chromium单细胞基因表达尊龙z6官网的解决方案(chromium single cell
gene expression solution),能够在单细胞水平上直接测定基因表达,从而定量细胞内的群体异质性,并逐个鉴定细胞类型、细胞状态和动态细胞跃迁。除了有望鉴定新的细胞亚型和稀有细胞群体,单细胞技术还能更好地了解转录动态和基因调控关系。
尽管在单细胞rna-seq和大量细胞表达实验中,每个样本所测序的转录本数目是相似的,但单细胞基因表达研究可以让您从传统的整体标志物基因分析延伸到细胞类型或细胞状态的鉴定以及伴随的调控通路中动态变化的鉴定,这是由多个基因驱动的。重要的是,单细胞基因表达还能实现细胞群体的无偏向鉴定,而不需要细胞亚型或细胞标志物的任何先验知识。为了充分利用单细胞转录组技术所带来的丰富知识,您在第一次开始实验之前应当考虑有关实验设计、样本制备和下游数据分析的一些相关步骤。本指南将帮助您开展单细胞基因表达实验,并充当路线图,帮助您设计实验,优化实验参数,并确定计算/分析工具,以便更好地分析您的单细胞基因表达数据。
准备单细胞基因表达实验
需要考虑哪些因素?
step1
我想回答哪些科学问题?
单细胞基因表达分析可以为许多不同类型的研究问题提供答案。这些问题包括但不限于:
a. 我想表征、鉴定、绘制或登记组织或器官中的混合细胞群体
b. 我想表征或鉴定复杂细胞过程中所涉及的新颖生物标志物或调控通路
c. 我想表征或鉴定复杂细胞过程中所涉及的新颖细胞类型或状态
step2
制备和处理样本的最佳做法是什么?
a. 样本类型 & 制备
关键是您要获得分离良好的细胞悬液、无细胞碎片、极少细胞团块,且细胞活力高(>70%)。了解您所研究细胞的大小范围也很重要。细胞大小通常与细胞表达的转录本数量有关。各种尺寸不同的细胞(直径高达>30 μm)均可与我们基因表达尊龙z6官网的解决方案中使用的chromium单细胞芯片兼容。
一般来说,细胞制备方案将根据组织来源和细胞类型而变化。每种组织类型都是独特的,因此,必须在开始任何单细胞实验之前优化样本制备(最佳的样本制备指南详见:go.10xgenomics.com/scrna-3/optimal-sample-prep)。冷冻保存、固定(详见甲醇固定的演示方案:go.10xgenomics.com/scrna-3/methanol-fixation),以及从长期保存的样本中分离细胞核(详见细胞核分离的演示方案:go.10xgenomics.com/scrna-3/nuclei-isolation)这些替代的制备方案也与我们的系统兼容。
b. 样本处理
在分离或组织解离后快速处理样本的能力对维持细胞完整性和保留每个细胞的转录组至关重要。请注意,任何样本操作都有可能对基因表达谱、细胞状态或细胞活力产生不利影响,并在研究中引入偏好性(van den brick s.c. et al, nat. met, 2017)。
step3
我的实验需要多少细胞和重复?
step4
我该如何分析和可视化我的数据?
b. 数据可视化loupe cell browser是一款桌面应用程序,适用于快速、交互式的单细胞数据可视化和分析。为了加速新的标志物基因的探索,您可以鉴定稀有的细胞类型,探索数据中的新型子结构,而不需要事先掌握编程知识(详见在线教程 go.10xgenomics.com/scrna-3/visualization-tutorial)。
cell ranger pipeline生成的输出文件可以通过大部分以r或python语言开发的开源软件包来解释分析。单细胞基因表达分析最常用的一些软件包是seurat和monocle。如果您具有编程基础,则可通过这两种r语言软件包开展qc检验、二次分析以及对单细胞基因表达数据的探索(详见 github.com/seandavi/awesome-single-cell或www.scrna-tools.org网站所列软件包)。
关于天昊
天昊生物具有多年基因组、转录组和表观组等多组学检测与分析的经验,现推出的10x genomics单细胞转录组测序可为您提供专业的科研服务及个性化的单细胞信息挖掘,期待成为您单细胞测序分析的优质服务提供商!
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