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发稿时间：2019-08-20来源：天昊生物

文章标题：mettl3 facilitates tumor progression via an m6a-igf2bp2-dependent mechanism in colorectal carcinoma

发表杂志：molecular cancer

影响因子：10.679

发表时间：2019年6月

中山大学肿瘤防治中心徐瑞华教授和鞠怀强教授团队在结直肠癌（crc）中发现mettl3能够基于m6a-igf2bp2的机制促进肿瘤进展。鉴于结直肠癌中并未有太多关于m6a rna甲基化修饰的报道，本研究首次在结直肠中证实了mettl3促癌的功能。

主要研究结果

1. mettl3在转移性crc中高表达且与不良预后相关

首先在tcga数据库中发现多个m6a相关‘写蛋白/擦除蛋白/读蛋白’的表达水平在结肠癌中异常表达(fig.1a)，qpcr验证了其表达水平(fig.1b)。由于mettl3在多个癌种中被证实高表达，进一步验证发现mettl3在复发性crc组织和转移性肝组织也呈现表达上调(fig.1c)，而且mrna和蛋白水平在crc细胞系也显示上调(fig.1d-e)。

mettl3蛋白水平在crc患者中表达上调(fig.1f)，免疫组化结果验证了mettl3在crc组织、淋巴结和肝转移组织中都显示出高表达(fig.1g-h)。更重要的是，mettl3高表达的患者化疗效果更差(fig.1i)，整体生存率和无病生存率更低(fig.1j)。

2. sox2受mettl3介导的m6a修饰调控

mettl3在sw620细胞中显示比sw480中具有更高的表达（两种细胞系具有不同的转移潜能，fig.2a），然后利用merip-seq和rna-seq在sw480、sw620和mettl3敲降的sw620细胞中寻找潜在的靶点。综合分析差异的甲基化peak和表达水平，发现与sw480细胞相比，sw620细胞中733个高甲基化peak同时具有更高的表达水平；在敲降的细胞中3393个低甲基化peak具有更低的表达水平(fig.2b)。从这两组结果中发现192个特异性的peak被共享(fig.2c)，与158个基因相关，通路富集发现这些可能参与干细胞分化的通路中(fig.2d)。

进一步对候选的基因分析发现四个基因sema3a、bche、zfp36l2和sox2在sw620细胞中显示出m6a修饰的大幅增加，而在敲降细胞中显示一致的减少(fig.2e)。然而m6a-qpcr实验证实sox2的m6a水平在敲降细胞中下降得最显著，因此sox2可能作为mettl3的潜在靶点参与到促进crc干性和转移过程中(fig.2f-h)。

3. 体外实验证实mettl3促进crc细胞干性

在mettl3敲降的sw620细胞中球体数目(fig.3a-b)、菌落形成、侵袭能力均受影响(fig.3c)，而对奥沙利铂的化疗敏感性增加(fig.3d)，癌症干细胞表面抗原cd133、cd44和epcam在mettl3被抑制后显著下降(fig.3e)，同时mettl3下游基因也被显著抑制(fig.3f)，另外sox2过表达能够rescue干性下降的表型(fig.3g-i)。这些结果表明mettl3在crc细胞中的致癌的角色，主要通过维持sox2的表达实现促进肿瘤的自我更新、细胞侵入和化疗抗性。

4. 体内实验证实mettl3驱动crc肿瘤发生和转移

通过异种移植实验发现mettl3敲降的细胞移植后肿瘤生长速率下降、肿瘤体积减小(fig.4a-b)；免疫组化发现尾静脉注射对照组sw620细胞的小鼠会出现更多的肺转移结节(fig.4c)。同样地，sox2过表达能够rescue肿瘤形成的功能(fig.4d)。利用pdx模型瘤内注射sirna评价mettl3的治疗作用，主要结果也与上述一致(fig.4e-h)。因此，体内实验确实证实了mettl3在crc中的成瘤和转移作用。

5. igf2bp2基于m6a修饰的方式增加sox2 mrna稳定性

先前有研究发现两类m6a读蛋白（readers）家族可能控制着甲基化修饰的mrna的命运，如yth家族和igf2bp家族。为了揭示sox2特定的m6a readers，利用链霉亲和素rna pull down实验检测相关的readers，发现igf2bp2特异性地结合在sox2全长转录本上，而非igf2bp家族其它成员或yth家族(fig.5a)。而且pull down实验也证实了igf2bp2主要结合在cds区，在motif缺失后特定的结合也会受到影响(fig.5b)。rip实验同样地证实了igf2bp2和sox2 mrna之间直接的影响(fig.5c)。

在抑制igf2bp2后sox2蛋白和mrna水平、sox2下游基因表达水平均受到显著抑制，igf2bp2和sox2转录本之间的作用也会受到mettl3的影响(fig.5d-h)。在抑制mettl3或igf2bp2后，sox2 mrna表达水平开始下降，而且其半衰期显著变短(fig.5i-j)。这些结果都能说明igf2bp2确实充当reader的角色，维持sox2转录本的稳定性。

6. mettl3/sox2/ igf2bp2在crc中的临床相关性

基于以上机制的发现，利用临床样本分析mettl3/sox2/igf2bp2之间的相关性，包括免疫组化实验、表达相关性，利用三个marker的ihc数据对crc患者进行预后的预测，三者的高表达显示了最差的预后，因此可以建立一个很好的预测模型(fig.6)。

研究总结

本研究发现了mettl3对于crc进展的关键作用及可能基于m6a的机制，mettl3-igf2bp2-sox2之间的调控作用是基于m6a这一表观调控机制来实现的，另外pdx模型显示mettl3作为潜在靶点可能具有一定的治疗作用。

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