南京农业大学食品科学技术学院近期在《free radical biology and medicine》上发表了黑果枸杞花青素对右旋糖酐硫酸钠导致的结肠炎小鼠肠道菌群的调控及抗炎作用的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的相对定量扩增子测序和生信分析工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。
英文题目：gut microbiota modulation and anti-inflammatory properties of anthocyanins from the
fruits of lycium ruthenicum murray in dextran sodium sulfate-induced colitis in mice
中文题目：黑果枸杞花青素对右旋糖酐硫酸钠导致的结肠炎小鼠的肠道菌群调控及抗炎作用
期刊名：free radical biology and medicine
影响因子： 5.657
发表时间： 2019年
研究概要：
研究了黑枸杞果实粗花青素（acn）和acn主单体（p3g）对右旋糖酐硫酸钠（dss）诱导的小鼠结肠炎的治疗作用。花青素（acn）和p3g均表现出肠道抗炎作用，主要表现在可以恢复各种体征（体重、饲料量、粪便固体重量和结肠长度增加，dai评分降低）、减少促炎细胞因子和相关mrna（如tnf-α，il-6, il-1β ， ifn-γ）表达以及通过组织学和免疫荧光证明促进肠道屏障功能（蛋白质如zo-1，occludin，claudin-1增加）。此外，还研究了dss诱导的小鼠结肠炎对肠道微生物群的影响，发现porphyromonadaceae, helicobacter, parasutterella, parabacteroides, oscillibacter, lachnospiraceae是炎症性肠病的主要病原菌。总之，p3g和acn通过阻断促炎细胞因子、增加紧密连接蛋白和调节肠道微生物群三个方面改善了dss诱导的小鼠结肠炎，而且，p3g比acn具有更好的抗炎作用。
研究背景：
溃疡性结肠炎（uc）和克罗恩病（cd）是炎症性肠病（ibd）的两种主要形式，在过去几十年中已成为西方世界主要的胃肠道疾病之一。cd影响从口腔到肛门的整个消化道，而uc主要影响结肠和直肠，因此可以将他们通过组织学外观区分开来。cd和uc是慢性炎症性疾病，在医学上无法治愈。目前最常见的治疗ibd的药物，如氨基水杨酸盐和免疫调节剂，已显示出严重的副作用，如影响肾功能。因此，越来越多的人需要从天然和功能性食品中提取替代品用于ibd治疗，如多酚、萜类和生物碱。
近二十年来，多酚物质一直是预防和治疗慢性病的重点，由于具有良好的抗炎、抗氧化、胰岛素敏感性作用和降低心血管疾病风险的能力，它们被公认为促进健康的植物化学物质。其中白藜芦醇、姜黄素、槲皮素和花青素是最常见的多酚类物质，其对ibd的治疗作用已在动物模型中得到验证，其治疗ibd的靶点通常包括核因子κb (nf-κb)途径和肠屏障功能的调节，但越来越多的研究表明肠道微生物群是一个重要靶点。肠道微生物群和特定的微生物群与免疫、营养、代谢等多种生理功能和健康状况密切相关。一方面，肠道微生物群对多酚物质的代谢可以提高多酚的生物利用度和生物活性。另一方面，多酚物质的代谢产物可以调节肠道微生物群的结构，从而影响肠道微生物群的代谢途径和代谢产物。因此，阐明这些指标之间的关系，找出关键的肠道微生物群是至关重要的。
枸杞是茄科枸杞属植物，是我国重要的经济作物。它营养丰富，尤其是花青素，具有多种生物活性。花青素是一类广泛存在于植物中的黄酮类化合物，是可溶性天然色素。它们具有广泛的药理活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌、神经保护和视力保护活性。我们以前的研究结果表明，从黑果枸杞中提取的花青素（acn）可以促进肠道微生物群中双歧杆菌的生长，降低厚壁菌与拟杆菌的比例，增加短链脂肪酸的产生，从而有利于促进肠道微生物群的生长，从而对人体肠道微生物群有有益的调节作用。p3g，作为黑果枸杞中的主要单体，具有很强的抗氧化活性。据报道，蓝莓、黑树莓、紫胡萝卜和黑米中的花青素对小鼠ibd有较好的缓解作用。此外，黑树莓的花青素还可以逆转右旋糖酐硫酸钠（dss）引起的肠道微生物群失衡，如脱硫弧菌和肠球菌的相对丰度增加，直肠真杆菌、普氏粪杆菌、乳酸杆菌相对丰度降低。在研究中，采用了花青素（acn）粗提物，然而，关于花青素单体对ibd影响的信息很少。因此，本研究采用dss诱导的小鼠结肠炎模型，研究了黑果枸杞中的花青素（acn）及其主要单体p3g的肠道抗炎作用，并对它们的抗炎作用进行了比较。
研究方法：
动物处理
5周龄雄性c57bl/6小鼠在标准实验室条件下饲养：25±2℃，50±5%湿度，12 h/12 h光/暗循环。40只小鼠平均分为4组（nc、dss、p3g-dss和acn-dss）。dss组、p3g-dss组和acn-dss组在第1-8天的饮水中给予1.5%的dss，而nc组给予无dss的饮水。9-16天，在p3g-dss和acn-dss组中给小鼠p3g（200 mg/kg/d）或acn200 mg/kg/d），nc和dss组则给小鼠饮用水。实验期间，每天测量体重、粪便固体重量和食物消耗量。结合（i）体重减轻分数（0: none, 1: 1-5%, 2: 5-10%, 3: 10-20%, 4: ＞20%）；(ii)腹泻分数（0:正常，1和2:大便松动，3和4:腹泻）；（iii）血液分数（0:正常，1: ，2: ，3: ，4: ）来获得评价ibd严重程度的疾病活动指数（dai）。体重下降的计算方法为原始体重（第0天）与任何特定日期体重之间的百分比差异。第17天处死小鼠，收集所有动物的结肠组织、血清和粪便样品。将血清、盲肠内容物和结肠的一半保存在80℃下进行实验，另一半结肠固定在4%缓冲甲醛中进行组织学观察。
血清细胞因子测定
应用酶联免疫吸附试验（elisa）试剂盒测定了肿瘤坏死因子α（tnf-α）、白细胞介素6（il-6）、白细胞介素-1β（il-1β）、干扰素γ（ifn-γ）和单核细胞趋化蛋白1（mcp-1）的含量。用商业试剂盒测定血清中脂多糖（lps）和前列腺素e 2（pge 2）的含量。
组织学评价
石蜡包埋结肠组织切片，苏木精和伊红染色。所有组织切片均采用盲法评估。根据炎症浸润程度（0-5）、隐窝损伤（0-4）、溃疡（0-3）和是否有水肿（0或1）对这些切片进行评分。
免疫荧光评价
在-20℃甲醇或丙酮中固定和渗透后，将结肠组织与一级抗体在4℃孵育过夜，然后在室温下与fitc标记的二级抗体孵育1h。然后用dapi进行核复染。荧光显微镜观察图像，在组织切片的同一区域采集dapi和fitc图像。
基因表达定量分析
提取结肠标本总rna，并使用nanodrop 2000分光光度计进行定量。cdna合成后，使用gapdh作为内参基因进行rt-qpcr。
短链脂肪酸含量测定
用气相色谱法（gc）标准曲线测定盲肠内容物、粪便和血清中的乙酸、丙酸、正丁酯、异丁酸、n-戊酸和异戊酸等scfa含量。在gc分析之前，通过旋涡和离心将适当量的盲肠内容物或粪便与5倍体积的水混合，并将所得上清液与等量的2-乙基丁酸（内标）混合。按报告方法进行血清处理，并按报告方法进行气相色谱分析。根据说明书用乳酸测定试剂盒测定乳酸含量。
微生物群落分析
采集小鼠粪便，经液氮冷冻后，置于-80℃保存。用qiaamp® fast dna stool mini kit粪便试剂盒提取小鼠粪便中总细菌dna。然后进行16s rdna扩增子测序（v4）。
研究结果：
花青素对dss诱导的结肠炎的作用明显
体重、饲料量、疾病活动指数（dai）评分、粪便固体重量和结肠长度的变化如图2所示。经dss处理后，体重、饲料量、粪便固形物量均明显下降。同时，dai得分迅速上升。dss停药后，体重、饲料量、粪便固体量逐渐恢复，dai评分同时下降。第16天，p3g-dss组体重与nc组基本相同（p>0.05），但明显高于acn-dss组和dss组（p<0.05）。nc组、p3g-dss组和acn-dss组的饲料量均高于dss组（p＜0.05）。然而，四组之间的固体粪便重量没有显著差异。四组的dai评分和结肠长度有显著差异：nc组结肠长度最长，p3g-dss组次之，acn-dss组次之，dss组次之，dai评分结果正好相反。
图2.（a）体重；（b）饲料量；（c）固体粪便重量；（d）dai评分；（e）结肠长度；（f）结肠长度照片（每组一个代表性结肠）。
花色苷对血清促炎细胞因子的影响
血清中促炎性细胞因子的含量如图3所示。与nc组相比，dss组所有促炎细胞因子均显著升高（p<0.05）。经p3g和acn治疗后，促炎细胞因子水平接近nc组，低于dss组（p<0.05）。一般情况下，黑果枸杞花色苷能抑制dss诱导的血清促炎性细胞因子水平。
图3.p3g和acn对血清炎性细胞因子表达的影响（a）tnf-α；（b）il-1β；（c）il-6；（d）ifn-γ；（e）lps；（f）mcp-1；（g）pge 2
组织学特征
h&e染色组织切片和组织病理学评分如图4a所示。nc组结肠病理形态正常，无炎症反应和损伤。dss处理小鼠结肠出现严重急性结肠炎，表现为杯状细胞和浅表上皮细胞消失，粘膜和粘膜下层大面积单核白细胞炎性浸润，肠黏膜与肌层间有水肿。两组花色素苷治疗小鼠的病理损伤均显著降低。p3g-dss组有轻微炎症反应，杯状细胞基本恢复正常，水肿明显改善，无炎性细胞浸润。acn-dss组中度炎症，杯状细胞损伤1/2，水肿改善不明显，与p3g-dss组比较，仍有少量炎性细胞浸润。根据结肠炎评分，p3g和acn均能改善炎症程度（p<0.05），p3g效果较好。
图4. a.苏木精、伊红染色结肠组织切片显微镜显示：（a）nc组；（b）dss组；（c）p3g-dss组；（d）acn-dss组；（e）各组结肠炎评分。b.4组claudin-1、occludin和zo-1免疫荧光的图像。紧密连接蛋白染色为绿色，核染色为蓝色。用image pro plus 6.0软件分析这些蛋白质的平均密度。
免疫荧光特性
zonula occludens-1 (zo-1)，occludin， caludin-1的免疫荧光分析结果如图4b所示。与nc组相比，dss治疗导致了三种蛋白含量的显著降低。与dss组相比，p3g和acn处理的小鼠这些蛋白质的含量增加。结果表明，花青素在蛋白质水平上促进肠屏障功能。
花青素对炎症和肠道完整性相关基因转录表达的调控
图5显示了p3g和acn对参与结肠炎症和结肠肠道完整性相关基因表达的影响。与dss组相比，花青素显著抑制了诱导型一氧化氮合酶（inos）、环氧合酶-2（cox-2）、tnf-α、il-6、il-1β、ifn-γ、mcp-1、toll样受体4（tlr-4）、nod样受体蛋白3（nlrp3）的表达（p＜0.05），促进了zo-1、occludin、 caludin-1、游离脂肪酸受体2（ffar2）和游离脂肪酸受体3（ffar3）。总的来说，黑色素果实中的花青素可以调节这些基因的表达，接近nc组水平。另外p3g在cox-2、tnf-α、ifn-γ、 ffar2的表达上比acn有更好的调节能力。
图5.p3g或acn对结肠中mrna相对表达的影响。(a) inos; (b) cox-2; (c) tnf-α; (d) il-6; (e) il-1β; (f) ifn-γ; (g) mcp-1; (h) tlr-4; (i) nlrp-3; (j) zo-1; (k) occludin; (l) caludin-1; (m) ffar2; (n) ffar3。
花青素对短链脂肪酸的影响
不同组别scfas的变化如图6所示。dss组盲肠内容物和粪便中乙酸、丙酸、异丁酸和总酸含量显著降低（p＜0.05），但血清中的含量变化不明显（p＜0.05）。经p3g和acn处理后，盲肠和粪便中乙酸、丙酸、异丁酸和总酸的含量明显高于dss组（p<0.05）。与dss组相比，经p3g和acn处理后血清无显著性差异。值得注意的是，血清中乳酸含量远远高于其他酸，血清乳酸含量各组间无显著性差异。
图6.p3g或acn对scfas（a、盲肠内容物、b、粪便、c、血清）的影响。
花青素和dss对肠道微生物群的影响
每个样本的稀疏曲线和shannon-wiener曲线趋于平坦，表明测序深度足够，测序结果可信。图7a显示了代表所有组α多样性的香农指数。p3g-dss和acn-dss组与nc组几乎相同（p>0.05）。相比之下，dss组的多样性明显低于nc组（p<0.05）。图7b显示了以主成分分析（pca）为代表的β多样性，表明dss显著改变了肠道微生物群，在此基础上，p3g和acn可以调节肠道微生物群。在门水平的细菌组成方面（图7c），与nc组相比，dss处理降低了bacteroidetes的相对丰度，增加了firmicutes的相对丰度，但没有统计学意义（图7d和7e）。p3g-dss组与dss组趋势相反，与nc组比较差异有统计学意义。结果表明，p3g-dss组firmicutes/bacteroidetes的比例显著低于nc或dss组（图7g）。此外，acn-dss组actinobacteria相对丰度最高（图7f）。
图7. p3g或acn调节dss处理诱导的肠道微生物群组成。（a）shannon指数获得的α多样性比较；（b）肠道微生物群pca分析；（c）门水平微生物组成柱状图；（d）bacteroidetes类杆菌的相对丰度；（e）firmicutes厚壁菌的相对丰度；（f）actinobacteria放线菌的相对丰度。（g）类杆菌与拟杆菌的比值。
dss处理后，porphyromonadaceae、rikenellaceae、prevotellaceae的相对丰度显著降低，而bacteroidaceae、 verrucomicrobiaceae、sutterellaceae的相对丰度显著高于nc组。然而，花青素能逆转dss诱导的porphyromonadaceae、rikenellaceae、prevotellaceae相对丰度的下降。但花青素对dss增加的bacteroidaceae、 verrucomicrobiaceae、sutterellaceae相对丰度无显著影响。
为了明确哪种细菌可能对ibd产生影响，采用lefse对相对丰度大于0.5%的otu进行分析，得到各群体的优势otus，结果显示，4组中85个占优势的otu使用heatmap热图一起显示（图8a）：值得注意的是，属于lactobacillus乳酸杆菌属的otu 168和otu 084是p3g-dss组的优势out，结果也显示在lefse分析结果中，共有15个不同的otu被花青素干预显著逆转。
通过spearman相关分析分析了15个不同的otu和ibd参数之间的相关性（图8b），结果发现，这15个otu与ibd的一个参数至少呈负相关或正相关，包括体重、dai评分、血清中炎性因子、肠长度、炎症和肠完整性相关基因在肠组织中的表达。其中，otu441、otu334、otu604和otu523与促进ibd的参数呈负相关，与预防ibd的参数呈正相关，其它11个otu恰恰相反。
图8.a. lefse分析dss、p3g或acn改变的肠道微生物群组成。（a）线性判别分析（lda）；（b）根据不同组85个otu的相对丰度得到的heatmap图；（c）dss或花青素干预引起的otu的变化方向；（d）otu代表细菌分类信息（门、科、属和种），利用tukey’s hsd检验计算otu相对丰度的差异；b.用spearman分析花青素干预逆转的15个otu与ibd参数的相关性。（a）heatmap显示相关系数的值。*和**表示有意义的关联（分别为p<0.05和p<0.01）；（b）otu表示细菌分类信息（门、科、属和种）。
除分类组成外，图9显示了picrust预测的不同组之间的功能差异。可以看出，功能的变化更多地依赖于p3g而非acn。与dss组的比较显示，经p3g和acn处理后，30个（22个富集，8个减少）和7个（3个富集，4个减少）功能模块分别显著改变（p<0.05）。acn的处理主要引起一些代谢途径的变化，如其它次生代谢产物的生物合成、能量代谢和异种生物降解代谢等。p3g的治疗导致更复杂的功能途径发生变化，主要是代谢、组织系统和人类疾病的途径，如转录因子、柠檬酸循环（tca循环）、氧化磷酸化、卟啉和叶绿素代谢。这说明花青素的干预有助于导致肠道微生物群的功能差异。
图9. picrust预测的花青素对微生物群落功能的影响。
研究总结：
苏州工业园区星湖街218号生物纳米园c13楼501单元
86(0)512-6295 9990
86(0)512-6295 9995
