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发稿时间：2019-08-14来源：天昊生物

  

东北农业大学农业生物环境与能源工程系近期在《journal of environmental management》上发表了总碳/硫酸盐对含硫酸盐废水与玉米秸秆共消化甲烷产生及硫酸盐去除的影响的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的相对定量扩增子测序工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：impact of total carbon/sulfate on methane production and sulfate removal from co-digestion of sulfate-containing wastewater and corn stalk

中文题目：总碳/硫酸盐对含硫酸盐废水与玉米秸秆共消化甲烷产生及硫酸盐去除的影响

期刊名：journal of environmental management    

影响因子： 4.865

发表时间： 2019年 

研究概要：

本研究在高温条件下对含硫酸盐废水和玉米秸秆进行厌氧共消化，研究总碳（tc）/硫酸盐（6、16、35、110）对甲烷生成和硫酸盐去除的影响。在tc/硫酸盐为35条件下，最高甲烷生成量为260.14 ml/g vs，显著高于tc/硫酸盐为6条件下的12.53 ml/g。此外，硫酸盐平衡分析结果表明，在tc/硫酸盐为16条件下，最大硫酸盐去除率为93.43%，共消化28天后，沼气浆中的硫酸盐浓度均小于0.1g/l，与tc/硫酸盐比值无关。采用16s rdna测序技术对微生物群落进行了分析，结果表明：甲烷主要由methanoculleus 和methanosarcina产生，通过desulfotomaculum去除硫酸盐。产甲烷古菌（ma）和硫酸盐还原菌（srb）的相对丰度与产甲烷量和硫酸盐去除量显著相关。结果表明，在适当的tc/硫酸盐条件下，对含硫酸盐废水和玉米秸秆进行厌氧共消化，可获得较高的甲烷产量和硫酸盐去除率。

研究背景：

以稀硫酸为原料，在秸秆解聚过程中产生大量高浓度硫酸盐有机废水，但是未经处理或处置不当，可能对环境造成严重影响，如设备腐蚀、所需微量金属元素流失、土壤酸化、产生有毒硫化氢气体、污染率高。氢氧化钙沉淀法处理高浓度硫酸盐酸性废水，由于成本较低，得到了广泛的应用，同时产生的硫酸钙沉淀法可作为工业和化工原料。但氢氧化钙沉淀对溶液的酸碱度敏感，石膏的溶解性限制了硫酸的去除效率，容易导致处理不彻底。根据《地表水环境质量标准》（gb3838-2002），水中硫酸盐浓度不应超过250mg/l。因此，氢氧化钙沉淀作为一种单一的处理方法可能不再适用，应开发新的处理方法或联合处理，以降低硫酸盐浓度，达到排放标准。然而，对于高浓度硫酸盐（约22.8g/l）的废水，使用氢氧化钙沉淀作为预处理可能更经济。厌氧消化是产生生物能源的固体有机废物处理最常用的方法。早期研究表明，加入较低浓度的硫酸盐可以改善厌氧消化的沼气生产性能。因此，经过氢氧化钙预处理后的低浓度硫酸盐有机废水可作为共基质，与玉米秸秆等其他沼气原料共消化，获得较高的甲烷产量，同时，有效地去除了硫酸盐。文献记载，在高硫酸盐浓度废水的厌氧消化过程中，化学需氧量（cod）/硫酸盐对甲烷的产生和硫酸盐的去除有显著影响。例如，hoa等人研究了上流式厌氧污泥床（uasb）系统中硫酸盐还原过程，发现电子流与硫酸盐还原菌（srb）的比例在80-85%之间，cod/硫酸盐的比例为2。据barrera等人报道，在cod/硫酸盐比例为10.0-5.0的情况下，硫化物抑制了产甲烷古菌（ma）和硫酸盐还原菌（srb）。然而，这些研究大部分集中在含硫酸盐的有机废水的处理上，含硫酸盐废水与玉米秸秆厌氧共消化产甲烷及脱硝研究较少。

值得注意的是，固体废物的有机负荷通常用挥发性固体（vs）或碳（c）元素含量来表示。因此，以前报道的最佳化学需氧量（cod）/硫酸盐不能准确指导含硫酸盐废水与固体废物的厌氧共消化。据我们所知，目前尚无关于化学需氧量（cod）/硫酸盐替代参数的科学报告，本文提出了一个可供选择的参数，即总碳（tc）/硫酸盐比，用于含硫酸盐废水与固体废物的直接厌氧共消化。本研究的主要目的是探讨总碳（tc）/硫酸盐对玉米秸秆含硫酸盐废水厌氧发酵产甲烷和去除硫酸盐的影响。采用间歇试验方法，比较了不同总碳（tc）/硫酸盐水平下玉米秸秆的累积产甲烷量、硫酸盐去除量、有机质降解量、结晶度指数和微生物群落特征。研究结果为含硫酸盐废水与玉米秸秆的厌氧共消化提供了一个有效的参数和合理的调节范围，有利于更好的设计实验。

研究方法：

基质和接种物：

本研究收集了糠醛（fscw）生产过程中的含硫酸盐废水。根据硫酸盐浓度和硫酸钙（caso4）分子，添加100%、125%、150%和175%的氢氧化钙，使硫酸盐完全沉淀。沉淀后，让溶液静置24小时，然后过滤上清液。最后，滤液的ph值调整为～5.6，作为共基质（w1, w2, w3, w4）。分析前，通过0.45μm微孔过滤器过滤fscw和含硫酸盐废水（w1～w4）样品。从哈尔滨市东北农业大学试验田采集玉米秸秆作为共基质。实验前将自然干燥的玉米秸秆粉碎成直径为1-2cm的玉米秸秆。从牛粪厌氧消化池中提取的55±1°c的厌氧污泥。

 

表1  fscw、含硫酸盐废水（w1-w6）、玉米秸秆和接种物的特性

实验设计：

在1000毫升锥形烧瓶（工作体积：700毫升）中进行批量分析，每个烧瓶装485克接种物。分别添加15g玉米秸秆和200g w1～w4含硫酸盐废水，使tc/硫酸盐达到6、16、35或110。为了评价底物的发酵性能，对玉米秸秆或含硫酸盐废水（w1～w4）进行了单次消化。添加一定量的蒸馏水，使发酵液的总物料量达到700 g，空白试验只含有485g接种液和215g蒸馏水。每种处理分三次进行，厌氧消化反应器使用30个锥形烧瓶。所有反应器放置在空气浴振荡器中，温度为55±1°c，每1-2天分析一次各处理过程中的气体样品。每2天监测一次发酵液的酸碱度。

实验参数：

根据标准方法测定总固体（ts）、挥发性固体（vs）、ph、钙和铁离子。硫酸盐和硝酸盐的浓度通过skalar流量分析仪测量。采用快速消解法对可溶性化学需氧量（scod）进行了分析。用气体检测管测定硫化氢。纤维素、半纤维素和木质素含量由半自动纤维素分析仪测定。使用气相色谱法测量沼气中的甲烷含量。采用元素分析仪测定了碳、氮元素含量。由于玉米秸秆中硫酸盐含量较低，故将基质中的tc/硫酸盐定义为硫酸盐废水和玉米秸秆中总碳含量与废水中硫酸盐含量的比值。利用x射线衍射仪（xrd）分析了6、16、35、110和未消化玉米秸秆在不同tc/硫酸盐条件下共消化的x射线衍射（xrd）图。

16s扩增子相对定量测序：

在共消化结束时，收集不同tc/硫酸盐条件下（6、16、35和110）的发酵液体，采用16s rdna测序技术对微生物群落的分布进行了分析。

研究结果：

甲烷产生

结果表明，对于tc/硫酸盐为6时，在第2天就获得12.53 mlg-1 vs的累积甲烷产量，但此后，甲烷产量几乎停止。由于基质在厌氧共消化初期不是一个限制因素，因此，硫酸盐还原产生的硫化物可能是产甲烷古菌（ma）活性迅速下降的原因，在tc/硫酸盐浓度为6的条件下，随着时间的延长，硫化物的生成量迅速增加，产生的硫化物不能以h₂ s的形式与沼气一起排出，从而存在于发酵液中，抑制了产甲烷。根据h₂ s/hs^-共轭离子分布曲线（图1b），硫化物的存在形式与ph值密切相关，研究表明当ph值为6.0时，90%的硫化物以h₂ s的形式存在于发酵液中，对产甲烷古菌（ma）的毒性远大于对hs^-和s ²⁻。在本实验中， tc/硫酸盐为6时，发酵液在3天后的ph值约为6.1，因此硫酸盐还原产生的硫化物主要以h₂ s的形式存在，导致对产甲烷的抑制。这个结果与16s rdna测序结果一致，结果表明，在tc/硫酸盐为6时，产甲烷古菌（ma）的相对丰度（如methanoculleus，methanosarcina）急剧下降（图6b）。

如图1（a）所示，由于在碳源利用中产甲烷古菌（ma）占主导地位， tc/硫酸盐（16、35和110）中的累积甲烷产量在3-11天内迅速增加，到第12天获得了总甲烷产量的90%。共消化结束时，总产甲烷量分别为226.97、260.14和249.56 ml/g，远高于玉米秸秆单消化时的180.34 ml/g。综上所述，我们的研究结果表明，在tc/硫酸盐为35时甲烷产量最高，当tc/硫酸盐降至6时，甲烷生成完全被抑制。

 

图1  a：厌氧共消化（a）过程中不同总碳（tc）/硫酸盐水平下甲烷产量的变化；b：h 2 s/h-在4-10时的共轭离子分布曲线。

h₂s产生

前两天共消化时，沼气中的h₂ s浓度非常低（图2a）。这可能是由于初始发酵液中存在硝酸盐导致的，硫化物氧化菌（sob）将硫化物氧化为硫酸盐，利用硝酸盐作为电子受体，导致h₂ s浓度较低。沼气中h₂ s浓度在第3天或第4天急剧上升，这是由于硫酸盐还原菌（srb）使用vfas作为底物将硫酸盐还原为硫化物，然后观察到沼气中h₂ s浓度下降。在共消化过程中，16的tc/硫酸盐比35和110的tc/硫酸盐具有较高浓度的h₂ s。10天后，35和110的tc/硫酸盐在沼气中很难检测到h₂ s，这可能是由于低硫酸盐浓度抑制了硫化物生成。共消化结束时，不同tc/硫酸盐（16、35和110）条件，h₂ s的累积产量分别为0.2240、0.1175和0.1468 ml/g（图2b）。

 

图2 厌氧共消化过程中不同tc/硫酸盐条件下沼气（a）h₂ s浓度和累积h₂ s产量（b）的变化

硫酸盐平衡分析

假设硫酸盐还原完全转化为硫化物，硫酸盐还原菌（srb）还原的硫酸盐物质量应等于发酵液中硫化物物质量和沼气中h₂ s的总和。根据这一假设，对不同的tc/硫酸盐进行了硫酸盐平衡分析。去除的硫酸盐随tc/硫酸盐比值的降低而迅速增加，最高去除的硫酸盐为1.69g/l，此时tc/硫酸盐为6（图3a），这与在此条件下获得的硫酸盐还原菌（srb）(desulfotomaculum)的相对丰度最高相一致。共消化28天后， tc/硫酸盐（16）的最大硫酸盐去除率为93.43%，高于tc/硫酸盐（35）的最大硫酸盐去除率（89.82%）和tc/硫酸盐（110）的最大硫酸盐去除率（75.54%），这可能是由于低浓度的硫酸盐抑制了硫酸盐还原菌（srb）的还原（图3a）。当tc/硫酸盐浓度降至6时，硫酸盐去除率降至87.21%。这表明，尽管硫酸盐的增加有利于srb利用硫酸盐，但srb没有完全利用过量硫酸盐，导致硫酸盐去除率下降。此外，srb产生的硫化物会抑制srb的活性，导致在低tc/硫酸盐条件下硫酸盐去除率降低。

图3（b）表明，总硫化物的产生与发酵液中硫化物的浓度没有太大差异。结果表明，发酵液中主要存在硫酸盐还原生成的硫化物（约占90%）。然而，发酵液中硫化物的存在形式因不同的tc/硫酸盐比值而不同。由于第6天之后，16、35和110的tc/硫酸盐发酵液的ph值分别为7.73、7.50和7.21，因此srb产生的硫化物主要以hs⁻的形式存在（图1b）。其对发酵微生物的毒性相对较低，这可能解释了高温硫酸盐中硫化物不抑制产甲烷过程的原因。而当tc/硫酸盐为6时，ph值约为6.11，这导致发酵液中的硫化物主要以h₂ s的形式存在，h₂ s对产甲烷古菌（ma）具有高度毒性。这与以往的研究结果一致，表明在tc/硫酸盐为6时，硫酸盐还原生成的硫化物抑制了产甲烷活性。

图3 共消化28天后，在不同的tc/硫酸盐中去除的硫酸盐（a）和产生的硫化物（b）

微生物群落分析

在共消化结束时，采用16s rdna扩增子测序分析了tc/硫酸盐对细菌群落整体结构的影响。不同tc/硫酸盐条件（为6、16、35和110）的otu数量分别为477、505、517和432（表2）。α多样性指数可用于评价每个样本的群落丰富度（chao 1 和 ace）和多样性（shannon）。在16和35的tc/硫酸盐条件下，群落的丰富度和多样性均高于其他tc/硫酸盐条件下，说明该条件下的厌氧共消化系统是稳定的。

 

分支的长度表示样本之间的距离，分支越近，样本的群落组成越相似。如图6（b）所示，16和35的tc/硫酸盐的群落组成相似。

发酵液中以hydrogenispora和clostridium_iii为主。当tc/硫酸盐小于35时，hydrogenispora的相对丰度随着tc/硫酸盐比值的增加而增加，可能是因为hydrogenispora可以利用碳水化合物产生氢和乙醇，有研究表明tc/硫酸盐的增加促进了硫酸盐还原菌（srb）对氢和乙醇的利用，从而促进了hydrogenispora的生长。

对于110的tc/硫酸盐，硫酸盐浓度较低会抑制srb的生长，导致发酵罐内乙醇大量积累，从而导致对hydrogenispora的反馈抑制。

clostridium_iii是一种嗜热厌氧菌，参与纤维素的降解和糖化。clostridium_iii的相对丰度与hydrogenispora相反，可能是由于同一基质的竞争。

结果发现35的tc/硫酸盐中的产甲烷古菌（ma）相对丰度（methanoculleus 和 methanosarcina）高于其它tc/硫酸盐（图6b），表明当tc/硫酸盐约为35时，产甲烷菌的生长增强，这与此时具有最高的甲烷浓度一致。

desulfotomaculum是一种著名的高温硫酸盐还原菌（srb），它以vfas为电子供体，将硫酸盐还原为硫化物，在tc/硫酸盐浓度为6时，desulfotomaculum相对丰度增加，硫酸盐去除量增加，在tc/硫酸盐浓度为6时，硫酸盐去除量达到最高。

以往的研究表明，ureibacillus能降解秸秆与稀硫酸解聚产生的有毒化合物，如糠醛和5-羟甲基糠醛。ureibacillus的相对丰度随着总硫酸盐含量的降低而增加，说明总硫酸盐含量较低的含硫废水可能含有较多的有毒化合物，这可能与氢氧化钙预处理有关。这也可能是当tc/硫酸盐为6时甲烷产量受到抑制的原因。tc/硫酸盐的降低可能导致发酵液中硫化物浓度的升高，与tepidanaerobacter还原铁产生的亚铁形成沉淀（硫化亚铁），从而促进tepidanaerobacter的生长，从而导致随着tc/sulfate的降低tepidanaerobacter的相对丰度增加。

 

图6 在不同的tc/硫酸盐条件下，厌氧共消化后的属水平细菌种群分布及热图

在本研究中，含硫酸盐厌氧共消化废水与玉米秸秆在总碳（tc）/硫酸盐条件下的发酵性能提高可能归因于三个主要因素：首先，通过与含硫酸盐废水共消化，提高了钙和铁的微量元素含量，这可能有助于提高甲烷的产量；其次，稀释有毒化合物，单一消化含硫酸盐废水（w1～w4），几乎不产生沼气，这不仅是因为高浓度的硫酸盐，还因为存在有毒化合物，如糠醛和5-甲基糠醛（玉米秸秆脱硫副产物），它们可以抑制产甲烷古菌（ma）的生长；第三，共消化有利于微生物群落多样性的增加，尤其是那些能够降解复杂底物和芳香化合物的细菌相对丰度的提高，导致木质素、纤维素和半纤维素的降解增加，从而提高沼气生产性能。