单细胞转录组测序（scrna-seq）技术在不同物种、不同组织及发育阶段中的应用越来越广泛，今天就跟大家分享一篇刚刚在国际顶级肾脏病学期刊《journal of the american society of nephrology》发表的研究论文，该文章用到了10x genomics平台探讨不同物种间（人、大鼠、小鼠、猪）肾内常驻巨噬细胞基因表达的特征。
single-cell rna sequencing identifies candidate renal resident macrophage gene expression signatures across species
题目：单细胞rna测序鉴定跨物种肾内常驻巨噬细胞候选基因表达特征
发表杂志：j am soc nephrol 影响因子：8.655 发表日期：2019-5
研究背景：
常驻巨噬细胞调节包括肾脏在内的多种组织的稳态和疾病过程。尽管有明确的标记来识别小鼠中的这些细胞，但技术限制阻止了不同物种间相似细胞类型的识别。无法识别跨物种的常驻巨噬细胞群阻碍了从动物模型获得的数据向人类患者的转化。本研究以小鼠、大鼠、猪和人肾组织中所有除去t细胞和b细胞的cd45先天免疫细胞scrnaseq分析为切入点，确定能够跨物种识别常驻巨噬细胞的新标记。
实验材料及方法：
单细胞获得
小鼠：取8周大c57bl/6野生型雄性小鼠肾脏，用无菌刀片切碎(约0.15克)，并在37℃酶液消化30分钟。10x genomics实验中，3只野生型雄性小鼠肾脏样本合并后用于测序。
大鼠：取3个月大的雄性sprague–dawley大鼠肾脏，称取约2.5 g含有皮质和髓质的肾组织。用无菌刀片将肾切碎，在37℃用酶液消化30分钟。
猪：取6个月大的雄性猪肾脏。称取约2.5 g含有皮质和髓质的肾组织。用无菌刀片将肾切碎，并在37℃用酶液消化30分钟。
人：在切除后4小时内从外科肾切除术中收集残余的人肾组织。对于scrnaseq，从一名60岁白人男性获得正常肾组织，其血清肌酐(0.8-1.2 mg/dl)正常，有外生性3厘米病变。在3名成年患者(平均年龄63 ± 8岁，两名男性和一名女性，两名白人和一名黑人)的相对未受影响的肾组织上验证了由scrnaseq鉴定的标记。肾组织用无菌刀刀片将2.5 g含有皮质和髓质的组织切碎，并在37℃下酶液消化30分钟。
消化后，肾脏碎片通过70微米过滤器，获得单细胞悬浮液。细胞用溶液重悬，在室温下用相应抗体染色30分钟，小鼠：pe rat anti-mouse cd45，bv786 hamster anti-mouse cd3e和percp-cy5.5 rat anti-mouse b220；大鼠：pe anti-rat cd45，apc anti-rat cd3和pe/cy7 anti-rat cd45ra；猪：mouse anti-pig cd45和fitc mouse anti-human cd3e，第二抗体包括cy5 donkey anti-mouse igg；人：pacific blue anti-human cd45，bv605 anti-human cd3和alexa fluor 647 anti-human cd19。所有物种都用fixable aqua dead cell stain染色。加入一级抗体后，将细胞离心，在0.04% bsa中洗涤，再悬浮在1毫升0.04% bsa中。样本被采集到流式细胞仪中，并使用becton-dickenson facsariaii进行分选。
fluidigm c1测序
fluidigm单细胞cdna文库制备。简单地，facs分选后的巨噬细胞在dulbecco-pbs中重新悬浮至最终浓度为300-350细胞/毫升，并与fluidigm悬浮试剂混合，达到55%的最终浮力，这由预试验确定。将6微升混合细胞装载到fluidigm c1 ifc平板中(10-17微米捕获位点)，用于mrna序列。捕获的单细胞通过显微镜进行确认。接下来，裂解混合物、反转录混合物和预扩增混合物，最终构建的文库由illumina nextseq上测序。
10x genomics
根据标准方法制备10x chromium单细胞文库。简单地，facs分选的单细胞悬浮液、10x条形码凝胶珠和油被装载到chip中，通过chromium controller捕获凝胶珠乳液(gems)。全长cdna文库是通过在热循环器中孵育gems制备的。将含有cdna的gems破碎，并将所有单细胞cdna文库聚集在一起，用dynabeads myone silane beads通过聚合酶链反应进行预扩增，之后进行标准的测序文库构建，之后用illumina nextseq对最终构建的单细胞文库进行测序。
实验结果：
1）scrnaseq揭示小鼠肾脏先天免疫细胞聚类的不同
实验从肾脏中分离出除去淋巴细胞的免疫细胞群(cd45)，并使用10x genomics平台对细胞进行scrnaseq分析(图1a)。为了进行这项分析，研究者使用荧光标记抗体，排除了t细胞(小鼠和猪的cd3e，大鼠和人的cd3)和b细胞 (小鼠的b220，大鼠的cd45ra，人的cd19)。最终分别分析了来自小鼠、大鼠、猪和人肾脏组织的3013、3935、4671和2868个单细胞。使用无偏分级聚类和热图分析法显示了每种物种独特的内免疫细胞图谱，每种颜色代表不同的细胞群体(图1b和1c)。
图1、scrnaseq识别肾脏先天免疫中具有独特基因表达模式的细胞群。(a)实验设计示意图。(b)小鼠、大鼠、猪和人肾脏先天免疫细胞的tsne图和(c)热图。
为了理解先天免疫细胞的保护并确定这些细胞在不同物种间的标记，研究者首先使用自已发表文献和在线数据库的先天免疫细胞群体的标准标记，从小鼠scrnaseq数据中分离细胞群体。使用指定的基因，通过tsne图和小提琴图来识别小鼠肾中不同类型先天免疫细胞（图2）。
图2、经典标记可用于识别小鼠肾脏中不同的先天免疫细胞簇。tsne投影和伴随的小提琴图描绘了用于鉴定(a)嗜中性粒细胞(lcn2)，(b)自然杀伤细胞(gzma)，(c)免疫球蛋白样细胞(il7r)，(d)免疫球蛋白样细胞(itgam，ccr2)，(e)常驻巨噬细胞(adgre1，cd64)和(f)树突状细胞(snx22，batf3)的基因。
2）比较分析确定富集于常驻巨噬细胞新的基因
使用上面的标记基因，研究者手工注释tsne图中用于检测小鼠肾脏中已知的先天免疫细胞群(图3a)。结果强调了小鼠肾脏中嗜中性粒细胞、自然杀伤细胞、白细胞、巨噬细胞和树突状细胞的不同簇的存在。为了鉴定小鼠肾脏先天免疫细胞的新标记基因，研究者使用seurat来鉴定图3a中每个细胞群中存在的最高差异表达基因。用这种方法确定了一系列候选基因，它们的表达在小鼠的每一个先天免疫部分都很丰富，并且包括已知和未知的标记(图3b)。使用这种无偏方法，识别几种特异性表达转录物，以及胚胎来源的常驻巨噬细胞(图3c)。
图3、scrnaseq可用于鉴定小鼠肾脏先天免疫细胞的新标记。(a)根据图2中确定的典型基因的表达，对小鼠肾脏的单细胞进行人工注释。(b)识别每个先天免疫细胞中新基因表达特征的热图。(c) 不同细胞中的新基因的tsne和小提琴图。
3) 使用fluidigm c1序列验证10x genomics数据
为了进一步验证10x genomics寻找的新标记物，本研究使用流式细胞仪根据常规标记物对有限和常驻巨噬细胞群进行分选，并使用fluidigm c1技术进行scrnaseq分析。c1数据的主成分分析图、小提琴图和热图分析表明，有限和常驻巨噬细胞表达独特的基因特征，与10x genomics相匹配(图4a-c)。
图4、fluidigm c1 scrnaseq可在小鼠常驻巨噬细胞中检测到degs。(a)主成分分析图，(b)小提琴图和(c)热图。
4) scrnaseq揭示物种间常驻巨噬细胞基因表达模式的保守性
接下来，研究者评估在从大鼠、猪和人肾脏分离的cd45阴性先天免疫细胞中是否可以发现相似的基因表达模式。首先选择用于明确识别小鼠中常驻巨噬细胞的最高差异表达基因 (c1qc)，并在每个物种的序列数据中寻找该基因的存在。值得注意的是，tsne和小提琴图显示了在来自小鼠、大鼠、猪和人类组织的单细胞数据中富含c1qc表达的独特细胞群的存在(图5a)。为了测试候选常驻巨噬细胞基因表达模式是否存在于不同物种中，研究者搜索了在小鼠常驻巨噬细胞中富集的来自大鼠、猪和人肾组织的单细胞数据另外三种顶级差异表达基因(cd81，cd74，apoe)。tsne和小提琴图显示，每个基因在每个物种的一个共同细胞群中发现(图5b-d)。这些数据表明候选常驻巨噬细胞基因表达模式可能在跨物种常驻巨噬细胞中保守。
图5、scrnaseq数据识别了多种物种中独特的细胞群，这些细胞群与小鼠体内的巨噬细胞具有相同的基因表达模式。
然后研究者人工将细胞分为嗜中性粒细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、常驻巨噬细胞和树突状细胞(图6)。
图6、scrnaseq识别不同的肾先天免疫细胞。(a)人工注释的小鼠、大鼠、猪和人先天免疫区室的tsne图。(b)tsne和小提琴图，显示了常用的人巨噬细胞标志物(cd68、cd163、cd14、fcgr3a)在人肾组织的scrnaseq数据中的表达。
本研究使用scrnaseq数据来鉴定小鼠常驻巨噬细胞的新标志物，这些标志物可能存在于跨物种的候选常驻巨噬细胞上。为了证实鉴定的新标记物富集在小鼠肾常驻巨噬细胞中，研究者对从野生型小鼠肾中获得的单细胞进行了分类，并寻找新的识别巨噬细胞标记物(c1q，cd81，cd74，apoe)的存在。作为对照，我们还分析了这些标记在免疫巨噬细胞中的表达。流式细胞仪数据分析表明，与有限巨噬细胞相比，常驻巨噬细胞中表达c1q、cd81和cd74的细胞数量和平均荧光强度增强(图7)。
图7、由scrnaseq鉴定的基因在蛋白质水平上富集在小鼠体内的巨噬细胞中。
5）使用新标记识别的常驻巨噬细胞与外周血的交换最少
为了确定使用新方法鉴定的候选常驻巨噬细胞缺乏与外周血的交换，这是组织常驻巨噬细胞的特征，研究者在cd45同源小鼠(cd45.2和cd45.1)中应用了共生模型。我们的数据表明，使用新标记物鉴定的候选常驻巨噬细胞嵌合率为2%-6%。总的来说，本研究数据证实，使用新标记物确定为候选常驻巨噬细胞的细胞群被小鼠外周血细胞所替代的程度最低。
研究结论：
1、利用scrnaseq技术鉴定了小鼠肾常驻巨噬细胞中表达丰富的基因。
2、使用scrnaseq数据为这些候选肾常驻巨噬细胞确定了一组新的细胞表面标记。
3、除小鼠外，在人、大鼠、猪等多种物种中鉴定了肾常驻巨噬细胞。
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