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发稿时间：2019-02-20来源：天昊生物

cell reports: the neonatal and adult human testis defined at the single-cell level

研究背景

精子形成过程更多地在啮齿类动物中被研究，而对人类精子形成的过程知之甚少，并且两者之间存在显著不同。在人类的相关研究中，精原干细胞（sscs）是一个焦点，因为其在临床上可能被用于治疗不育；另外一个较活跃的领域则是鉴别标记sscs的蛋白marker和形态学研究。然而很多这些marker并不能鉴别未分化的精原细胞（spg），也不能区分分化中的spg。当前的spg单细胞rna测序（scrna-seq）文章主要排除了其它睾丸细胞进行的分析，或多或少存在着一定的局限性，而这篇文章理论上分析了人类睾丸样本中所有的细胞类型。

主要内容

1. scrna-seq揭示成人睾丸样本中spg细胞亚群

利用10x genomics chromium single cell kit [v2 chemistry]进行文库制备，scrna-seq分析了两个能生育个体的睾丸细胞样本（37y和42y），质控后共18723个细胞用于后续分析。其中多种已知的睾丸细胞类型被发现，包括spg和spc（精母细胞）等（图1a），而进一步对spg细胞亚群进行分析发现其由4种不同的细胞群体组成，包括ssc-1, ssc-2,早期分化的spg及分化的spg（图1b）。ssc-1和ssc-2中多数细胞有明显的细胞周期基因表达特征，表明它们处于g0或g1期，而较少的细胞处于s期或g2/m期，这也说明多数ssc-1和ssc-2细胞并未增殖或经历缓慢增殖（图1c-d）。为了探索这四种spg亚群之间发育关系，基于差异表达的基因进行了monocle拟时轨迹分析，将单个细胞沿发育轨迹进行排列，结果表明这些细胞亚群按如下发育顺序：ssc-1→ssc-2→early diff-spg→diff-spg（图1e）。

图1成人睾丸样本中spg细胞亚群

2. 过渡细胞及3种未分化spg状态的发现

monocle分析发现在拟时轨迹线性路径中存在一类分支细胞（图1e顶部），这类monocle定义的细胞又具有三类不同的细胞亚群的特征—ssc-1, ssc-2和早期分化的spg，聚类分析也能将这些细胞聚在一起，继而推测这些细胞可能是由一类过渡细胞（transition cells, tcs）组成，将ssc和分化的spg阶段连接起来（图2a）。而支持这一假设的依据则为marker基因的表达在早期和晚期细胞中均有出现，而tcs中也共表达了ssc-1和ssc-2中的marker基因（图2a下，2b），在分析过程中也排除了可能由cell doublets带来的影响。

在ssc-1中发现一些基因表达在明显不同的区域（zones），可能是在ssc-1亚群中存在不同的细胞状态（图1b底部），因此仅对ssc-1细胞进行聚类分析。结果显示了三类亚群的存在—ssc-1a, ssc-1b和ssc-1c（图2c-d），三类细胞亚群选择性表达特定的marker基因（图2e）。拟时轨迹分析也发现这三类细胞或单独，或与其它细胞联合，其中ssc-1b细胞富集了最多的ssc（图2f）。

图2 未分化spg亚群

3. 候选的ssc蛋白marker的鉴别

鉴别人的ssc蛋白marker对于人的ssc研究至关重要，因此利用ihc和if的方法分别鉴定未分化spg的marker（图3a-c），结合单细胞测序分析发现piwil4和lppr3能够标记一类高度特异性的未分化spg亚群，具有ssc的特征。

图3 未分化spg marker鉴定

4. 新生儿睾丸样本中的细胞亚群

为了评估成人睾丸原始未分化spg细胞的发育起源，研究人员又利用scrna-seq分析了新生儿睾丸样本，质控后来源于两位新生儿（2d和7d）睾丸的14862个细胞被分析。基于已知的marker基因通过聚类分析发现了5种细胞亚群（图4a）。为了进一步阐明新生儿睾丸中生殖细胞（germ cells）的本质，仅对germ cells进行聚类分析，基于一些marker基因又发现了2种新生儿germ cells亚群（图4b），即pgcl和prespg（prespg-1和prespg-2）。

为了进一步揭示这三类新生儿germ cell亚群，将已发表的单细胞转录组数据纳入分析，数据来源于4w-19w胎儿的pgcs。pearson相关性分析发现所有5个妊娠期的pgcs基因的平均表达水平与pgcl亚群相近（图4c）。进一步探寻pgcs和germ cell数据间的发育关系，再进行monocle轨迹分析，基于marker基因发现这些细胞亚群按如下发育顺序：pgc→pgcl→prespgs（图4d）。

5. pgcl蛋白marker的鉴别

数据表明pgcl亚群在胚胎pgcs和成人spg间是一个重要的过渡阶段，利用ihc方法对pgcls中差异表达基因进行鉴定以寻找特定的蛋白marker，发现3种蛋白，etv4, pim2和pou5f1选择性标记这些细胞（图4e）。

6. 新生儿germ cell发展到近成人ssc的状态

为了确定新生儿germ cell和成人ssc之间的关系，对两者进行合并聚类分析，其中ssc-1细胞形成了大的细胞群，囊括了prespg-1和prespg-2（图4f）。拟时轨迹较好地验证了pgcl细胞是最未分化的新生儿细胞亚群，其它依次为prespg-2, prespg-1和ssc-1（图4g）。

图4新生儿睾丸样本中的细胞亚群

7. 体细胞出现在发育的和成人的睾丸中

为了更精确的确定新生儿和成人睾丸中的体细胞，需要仅对新生儿和成人睾丸中的体细胞进行聚类分析（图5a-b），细胞周期基因表达分析发现体细胞几乎没有处于细胞周期的更新中（图5c）。类似于以上分析步骤，对这些体细胞群也进行了marker基因分析和拟时轨迹分析（图5d-f）。

图5 睾丸样本中体细胞亚群分析

结论

男性生殖细胞发育是个复杂的过程，从胚胎生殖细胞到pgcs，再通过一系列状态的改变，包括增殖、凋亡和分化形成sscs，sscs通过自我更新和分化，继而生成精子。生殖细胞发育过程模型如图6所示。

图6 男性配子发育过程模型图

参考文献：

1.  guo, j. et al. chromatin and single-cell rna-seq profiling reveal dynamic signaling and metabolic transitions during human spermatogonial stem cell development. cell stem cell 21, 533-546 e6 (2017).

2.  sohni, a. et al. the neonatal and adult human testis defined at the single-cell level. cell rep 26, 1501-1517 e4 (2019).

3.  guo, f. et al. the transcriptome and dna methylome landscapes of human primordial germ cells. cell 161, 1437-52 (2015).