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发稿时间：2019-01-07来源：天昊生物

研究背景

白桦是中国北方常见的树种，具有很高的经济和药用价值。研究者多年致力于白桦基因组研究。叶绿体的完整基因组序列(cpdna)作为主要细胞器基因组，对于研究物种的差异、rna编辑和系统发育都非常重要。在本研究中，研究者对白桦的完整叶绿体基因组序列进行了测序和分析。

研究方法

植物材料和测序

使用ctab法从嫩叶中提取总基因组dna。构建paired-end (insert sizes = 200 bp, 500 bp 和

800 bp) 以及mate-pair (insert sizes = 2 kbp, 5 kbp和10 kbp)文库，利用illumina hiseq 2000进行随机测序。

数据过滤和cpdna序列提取

使用ngsqc toolkit (cut-off read length for hq = 70%, cut-off quality score = 20, trim reads from 5’=3, trim reads from 3’=7)过滤原始reads。使用fastqc检查clean reads质量。为了鉴定cp序列，所有clean reads，包括来自细胞核和细胞器的序列，被映射到2670种植物的完整cpdna序列，这些序列使用bwa工具从ncbi细胞器基因组资源数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/organelle/)下载。最后从sam文件中提取cp序列，并获得三个paired-end reads文件。

基因组组装和注释

对于de novo cp基因组组装，使用缺省参数的edena组装程序，将所有成对末端序列组装成contigs。接下来，使用sspace将相邻的具有成对末端或成对配对支撑的contigs合并成scaffolds。然后，利用另外两种参考壳斗科植物——betula nana (kx703002.1)和ostrya rehderiana (kt454094.1)的cp基因组序列，组装出一个带有间隙的cp序列。此后利用gapcloser用来补充大部分缺口，sanger测序被用来填补剩余缺口。使用bwa进一步检查完整的cp基因组序列。

除了trna基因，使用trnascan-se 2.0进行验证，白桦cp基因组序列使用在线叶绿体基因组注释、可视化、分析和genbank提交工具(cpgavas)进行注释。首先，annotategenome被用来获得gff3格式的原始注释结果。其次，研究者使用annotategene、apollo genome annotation和curation tool，根据cpgavas的参考数据库和trnascan-se进行trna基因注释，进行手动纠正。最后，使用organellargenomedraw生成修正的cp圈图。

密码子使用和替代起始密码子统计

确定所有蛋白质编码基因的密码子使用情况(rna序列未经编辑)。为了检查同义密码子使用的偏差，同时避免氨基酸组成的影响，使用mega 7软件计算相对同义密码子使用情况。

对三个cp基因( rps19、psbc和ndhd )用白桦cp基因组中的非atg起始密码子进行注释，根据被子植物系统发育组( apg ) iv系统从30种模式植物和代表性植物物种中选择了这些基因。然后，这三个基因中第一个10 bp的序列logo使用weblogo 3应用程序创建，研究者还可视化了这些位点的rna-seq图谱，并将它们与序列logo进行对。

基因组比较

利用mvista程序比较白桦和其他四个密切相关物种的完整cp基因组序列，这四个物种分别是b. pendula (lt855378.1)、b. nana (kx703002.1)、corylus chinensis (kx814336.2)和juglans sigillata (kx424843.1)。使用needleman-wunsch算法的改进方法emboss stretcher进行全局比对，用于比对这些cp基因组序列。

ir扩展和收缩分析

根据壳斗科分类系统，选择了betula platyphylla、juglans regia (mf167463.1)、morella rubra (ky476637.1) 和 castanea mollissima (ky951992.1)四种植物分别代表桦木科、胡桃科、杨梅科和壳斗科。

ssr分析

通过将单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最小重复次数分别设置为10、5、4、3、3和3，使用perl脚本misa (微卫星识别工具)检测简单序列重复。同时，candissr被用于鉴定多态性ssrs ( polyssrs )，并为三个桦木物种自动设计引物对。

rna编辑位点的识别

利用3片叶子样本的rna-seq实验来识别rna编辑事件。从成熟树叶中提取总rna，构建文库进行测序。使用hisat2软件与白桦cp基因组进行比对。samtools、beddtools和chloroseq被用来调用和分析精确的rna编辑位点。因为snps或错配可能会干扰结果，研究者还使用bowdtie 2软件将一组用于组装白桦cp基因组的pe100 bp长度reads映射回cp基因组序列，然后检查snps。最后，使用primer premier 6.0软件设计了几对引物，进行目标序列 pcr，利用sanger测序证实了目标代表性编辑位点。

系统发育分析和特征进化

利用21种壳斗科植物的全部cp基因组序列构建系统进化树，以确认密切相关的白桦物种之间的遗传关系。在进化树中，烟草被用作外部群体。使用mafft比对核苷酸序列。手动检查和调整所有比对结果。mega-cc用来寻找最佳替代模型，建立最大似然( ml )系统进化树。使用具有500次重复的自举重采样来评估分支支持情况。

研究结果

白桦的完整cp基因组长度为160518 bp，包括一对26056 bp的反向重复序列( irs )，它将89397 bp的大单拷贝( lsc )区域和19009 bp的小单拷贝( ssc )区域分开。注释结果包含129个基因，包括84个蛋白质编码基因、37个trna基因和8个rrna基因。使用替代起始密码子的基因有3个。比较基因组学显示，壳斗菜属物种cp基因组的序列相对保守，但仍有一些高变异区可用作分子标记。白桦的ir扩增事件导致了更大的cp基因组和rps19假基因的形成。简单序列重复( ssr )分析表明，白桦cp基因组中有105个ssr。rna编辑位点识别表明cp基因组中至少发生了80次rna编辑事件。大多数替换是c到u，而一小部分不是。特别是rrna上的三个编辑位点被转化为两个以上从未报道过的碱基。对于同义转换，其中大多数增加了密码子的相对同义密码子使用( rscu )值。系统发育分析表明，白桦树b. platyphylla与b. pendula的进化关系比b. nana更密切。

部分研究图表结果

图1、白桦叶绿体基因组图谱。如箭头所示，圆圈内的基因被顺时针转录，圆圈外的基因被逆时针转录。灰色内圈对应于gc含量。属于不同功能组的基因以不同的颜色显示

表1、白桦叶绿体基因组基因列表

图2、三个基因的序列logo和rna-seq图谱。a：该物种三个基因中10 bp的序列logo图。b：白桦三个基因中10 bp的rna-seq比对结果

图3、以白桦为参照，利用mvista程序对壳斗科植物的5个叶绿体基因组进行序列比对结果。比对上方的灰色箭头表示基因的转录方向。基因组区域被颜色编码为外显子和保守的非编码序列( cns )。本图使用了50%同一性的分界线。y轴表示50 %到100 %之间的同一性百分比

图4、四个壳斗科植物基因组中lsc、ssc和ir区域边界的比较。ψ表示假基因

表2、rna编辑位点和氨基酸变化列表（部分）

图5、通过sanger测序验证从rna-seq推断的编辑位点

研究结论

在这项研究中，研究者不仅获得并注释了白桦的完整cp基因组序列，还鉴定了新的rna编辑位点，并预测了壳斗科植物物种之间的系统发育关系。这些发现将促进这一重要物种的基因组、基因工程和系统发育研究。

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