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发稿时间：2018-09-10来源：天昊生物

     

英文题目: gut microbiome analysis as a tool towards targeted non-invasive biomarkers for early hepatocellular carcinoma

中文题目：肠道微生物可作为早期肝癌靶向非侵入性诊断生物标志物

期刊名：gut

影响因子： 17.016

发表时间：2018年7月

研究背景:

肝癌已经成为了所有癌症中排名第三的“杀手”，根据2015年的统计数据，中国新发肝癌病例达到46.6万，其中男性的数量约为女性的3倍。发病率高的同时，预后也让人感到担忧，原因之一就在于早期诊断很困难。肝癌因为缺少特异性的标志物，很多患者确诊时就已经是晚期了，死亡率与发病率的比值能够达到0.95。因此，迫切需要新的早期肝癌诊断标志物。

研究目的:

• 研究肝癌（hcc）患者肠道菌群特征；
• 寻找肝癌（hcc）非侵袭性微生物诊断标志物。

研究对象：

本研究共收集了来自华东，华中和西北地区的486份粪便样本， 经过严格的病理诊断和排除过程，完成了419个样本16s miseq测序，随机将其中321个样本分为发现组和验证组：在发现阶段，通过75例早期肝癌患者、40例肝硬化患者和75例健康对照进行了肠道微生物特征解析；利用早期肝癌患者队列与非肝癌患者队列（肝硬化患者和健康对照）进行了微生物标志物鉴定和肝癌诊断分类器构建；在验证阶段，接着对56例健康对照、30例早期肝癌患者和45例晚期肝癌患者对肝癌诊断分类器进行了验证。进一步通过对新疆的18个肝癌患者和郑州的80个肝癌患者对肝癌诊断分类器进行了独立诊断验证。

图1研究设计流程图。

研究结果：

参与者特点

• 在发现队列中（75例早期肝癌患者、40例肝硬化患者和75例健康对照）这3组参与者的临床特征包括年龄、性别和体重指数是匹配的。相对于对照组和肝硬化患者，血清甲胎蛋白水平在早期肝癌患者显著升高（表1）。血清丙氨酸氨基转移酶，天冬氨酸转氨酶、谷氨酰转肽酶、总胆红素、直接胆红素在早期肝癌患者明显升高，而总蛋白、白蛋白和血小板浓度则显著降低。

表1发现阶段受试者的临床特征

粪便形状和湿度

• 首先基于粪便常规测试评估粪便形态，并通过冷冻冻干试验测量粪便湿度。发现队列和验证队列所有样本的粪便特征是软的。发现阶段早期肝癌、肝硬化和健康对照组之间以及验证阶段对照、早期肝癌、晚期肝癌、新疆和郑州样本之间的粪便颜色均无显著差异。
• 在粪便水分方面，发现阶段早期肝癌、肝硬化和健康对照组以及验证阶段对照组、早期肝癌、晚期肝癌、新疆样本和郑州样本之间没有显著差异。

早期肝癌患者肠道微生物多样性降低

• 相对于健康对照组，肝硬化患者肠道微生物多样性显著降低；相对于肝硬化，早期肝癌患者肠道微生物多样性增加（图2a）。
• 相对于健康对照组，肝硬化患者粪便微生物多样性指数（shannon index, simpson index and invsimpson index）显著降低, 相对于肝硬化，早期肝癌患者肠道微生物多样性增加（图2b-d），
• venn图显示三组共932个otu中有524个共享。值得注意的是，932个otu中的90个对于早期肝癌患者是特异的（图2e）。

图2早期肝癌患者、肝硬化患者和健康对照的肠道微生物多样性

粪便微生物群落组成

• 拟杆菌属、厚壁菌属和变形杆菌属占总序列90%以上，为三个群体中的优势种群（图3a）。与肝硬化患者相比，早期肝癌患者的放线菌门明显增加（图3c）。而且包括gemmiger、parabacteroides和paraprevotella在内的13个菌属在早期肝癌患者明显增加（图3d）。
• 与健康人相比，早期肝癌患者疣微菌门（verrucomicrobia）细菌明显减少（图3e），从属的水平上来看，包括alistipes、考拉杆菌属（phascolarctobacterium）和瘤胃球菌属（ruminococcus）在内的12个属的细菌也明显减少了，与此同时，包括克雷伯氏菌属（klebsiella）和嗜血菌属（haemophilus）在内的6个属的细菌则增加了（图3f-g）。
• 通过lefse分析，肝硬化患者与早期肝癌患者，还有健康人与早期肝癌患者之间的肠道微生物组成有显著差异，这为建立肠道微生物标志物的早期肝癌患断模型提供了可能。

图3早期肝癌患者、肝硬化患者和健康对照肠道微生物组成。

早期肝癌微生物标志物的鉴定

• 我们构建了一个随机森林分类模型，可以特异性地将非肝癌患者和早期肝癌患者样本区分。为了检测早期肝癌的特异otu标记，我们通过发现阶段的75个早期肝癌和115个非肝癌样本（40个肝硬化和75个对照）对随机森林模型进行了五重交叉验证。结果发现，30个otu标记被选为最佳标记集（图4a）。
• 使用发现的30个otu最佳标记集对发现队列和验证队列的pod指数进行计算。在发现阶段,非肝癌患者和早期肝癌患者的auc值为80.64%，95% ci为74.47%～86.8%（图4b）。早期肝癌样本与非肝癌样本相比，pod值显著增加（图4c）。这些数据表明，基于微生物otu标记的pod对区分非肝癌患者和早期肝癌患者样本具有强大的诊断潜力。

图4通过随机森林模型鉴定早期肝癌微生物标志物

肝癌微生物标志物验证与独立诊断

• 在验证阶段，56个对照，30个早期肝癌和45个晚期肝癌用于验证pod对肝癌的诊断功效，计算每个患者的每个pod。
• 30例早期肝癌患者的平均pod值显着高于56例对照组，pod的auc值为76.80％，其验证了对早期肝癌的诊断潜力（图5a）。
• 为了说明pod对肝癌的特异性，我们进一步招募晚期肝癌患者以验证其诊断潜力。结果表明，45例晚期肝癌患者的pod值显著高于56例对照组（图5a），晚期肝癌患者（图5c）auc值达到80.40％,这表明对晚期肝癌具有明显的诊断功效。
• 为了进一步确定pod的诊断潜力和诊断范围，来自新疆（中国西北）的18例肝癌患者和来自郑州（中国中部）的80例肝癌患者作为独立诊断来验证pod可靠性。新疆18例肝癌和郑州80例肝癌与56例对照的平均pod值比较具有显著增加(图5a)。其中来自新疆的18例肝癌auc值达到79.20%(图5d)。郑州80例肝癌的auc值为81.70%（图5e）,这些结果表明基于微生物标志物的pod对中国西北部和中部地区肝癌患者有很强的诊断作用。

图5肝癌微生物标志物的验证和独立诊断。

研究结论：

1.  从肝硬化到早期肝癌粪便微生物多样性增加。

2.  相对于肝硬化，放线菌门在早期肝癌患者增加，包括gemmiger、parabacteroides和paraprevotella在内的13个菌属在早期肝癌患者明显增加。

3.  相对于对照，产丁酸属减少，而产生脂多糖（lps）的属在在早期肝癌患者增加。丁酸盐作为肠粘膜的主要能量来源，被认为是宿主细胞中基因表达，炎症，分化和凋亡的重要调节因子，在细菌能量代谢和肠道健康中起着关键作用。因此，产生丁酸盐的细菌的减少可促进肠粘膜破坏，从而有可能促使了肝癌的发生。lps的增加引发各种病理生理级联反应，高水平的lps激活nf-κb通路，产生促炎细胞因子（tnf-α，il-6和il-1）并导致肝脏炎症和氧化损伤，从而促使肝癌的发生。

4.  通过5次随机森林模型的交叉验证，确定了30个最合适微生物标记，在75个早期肝癌患者和105个非肝癌患者样本之间获得了80.64%的auc值。

5.  值得注意的是，肠道微生物标志物对早期肝癌患者甚至晚期肝癌患者具有很强的诊断潜力。重要的是，这些微生物标记物成功地实现了在西北和华中地区肝癌的跨区域验证。