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发稿时间：2018-07-18来源：天昊生物

在高等真核生物中，dna甲基化是基因组表观遗传调控的基础。目前，我们已经有全基因组甲基化测序（wgbs）技术，可以覆盖基因组的所有甲基化位点，但这一技术的价格目前仍然比较昂贵，数据分析也非常的复杂。因此，对于生物学活动相关基因组高cpg区域的捕获，将能实现更高性价比的甲基化水平检测。目前，这种覆盖基因组~10%甲基化位点的“甲基化测序平台”主要包括两类，一类是基因探针杂交捕获后进行测序（简称甲基化捕获），主要包括安捷伦公司，罗氏公司，illumina公司的甲基化捕获平台；另一种是基于mspl酶切的rrbs（reduced representation bilsulfite seuqneing,rrbs）平台，即基于限制性酶的rrbs测序平台。这两类技术都可以获得达到单碱基分辨率的甲基化水平检测结果，因此结果都比较准确，有利于后期的验证阶段工作。在甲基化标志物筛选研究中，都是非常关键的技术。

 

今天，小编和大家一起阅读一篇技术平台比对最新文章，看看现今的4种甲基化测序平台，各有什么样的优劣势。

文章题目：“same difference”: comprehensive evaluation of four dna methylation measurement platforms

杂志：. 

影响因子：5.351

发表时间：2018-05

 

• 本文对比的四种甲基化测序平台 （4个平台均覆盖人类基因组甲基化谱的10-13%）

 (1) 基于酶切的简化基因组测序-rrbs平台

(2) 基于捕获的agilent sureselect methyl-seq ---安捷伦ssmethylseq平台

(3) 基于捕获的roche nimblegen seqcap epi cpgiant---罗氏cpgiant平台

(4)基于捕获的 illumina truseq-methyl capture epic--- illumina truseqepic平台

 

 

• 四种甲基化测序平台覆盖度比较

 

安捷伦ssmethylseq 和 illumina truseqepic 主要是针对一条dna链进行捕获；但是某些含有snp的dna区域，illumina truseqepic 技术平台也会针对2条dna链都进行捕获；rrbs，罗氏cpgiant可以从2条dna链都进行片段捕获。依据下图（左），rrbs 的片段获取长度约为84-334bp（文库制备胶回收步骤的人为选择），这一长度范围和安捷伦ssmethylseq 技术平台较为接近。而罗氏cpgiant捕获区域通常更长，并且罗氏cpgiant和illumina truseqepic的长度分布比较广。基于捕获区域的重叠性分析（下图右），3个捕获平台之间的捕获区域重叠性较高。但可以观察到，4个平台的靶向区域还是有一定差别的。

 

• 实验操作参数比较

 

依据上表的参数对比，rrbs需要的dna用量最低，而安捷伦ssmethylseq需要至少1μgdna。价格上，4种平台的价格都很低廉，仅占wgbs（全基因组甲基化测序）的3.3~15.5%。

 

• 序列比对情况和正负链平等性情况比较

 

依据下图（左），四个平台的唯一比对序列占比平均能达到72.8%（sd=7.5%）。相比较而言，rrbs的未匹配序列或者模糊匹配序列占比较高（粉色和灰色区域）。下图（右）再一次强调了，安捷伦ssmethylseq 和 illumina truseqepic 主要是针对一条dna链进行捕获；而rrbs，罗氏cpgiant，wgbs可以从2条dna链都进行片段捕获。这一点对于关注链特异性甲基化水平的研究者比较关键。

 

•  cpg理论靶向区域的覆盖率情况

对于cpg位点测序read≥10的位点，我们定义为cpg单元。下图（左）统计了不同技术平台对于不同类型cpg单元的统计值。errbs, ssmethylseq, cpgiant  (平均都能获得121m的双端测序read), truseqepic 约获得54m的双端测序read) 三个平台获得的cpg单元数量约为3.84m；而wgbs获得的测序量约为300m的read，覆盖的cpg单元约为14.4m。对比各个技术平台，errbs平均覆盖了其理论靶的cpg单位区域的67.9％。 而罗氏cpgiant则平均覆盖了其预期cpg单位区域的98.3％（下图右）。

 

• cpg重叠单页的甲基化水平检测一致性（下图左侧ma图）

对于重叠检测到的cpg位点，4种平台的甲基化水平一致性很高，说明甲基化水平检测在不同平台之间主要是检测区域的差别，而检测出的甲基化水平是高度一致的。

 

• 基因功能区域的覆盖情况对比 

甲基化捕获平台为预先设计探针，重点捕获已知在表观调控中扮演重要作用的基因组功能区域，例如cpg岛、cpg shore，启动子区，部分内含子和外显子区，因此三个捕获平台对基因功能区的覆盖情况差别不大。rrbs也能覆盖相同的区域，但覆盖度偏低一些（下图 a）。对于在未注释基因区域，rrbs 技术平台覆盖度最高(下图c）。

 

 

• 总结

1. 总的来说，对于其目标检测区域，每个平台都有很高的捕获效率，但是不同平台的捕获区域还是有一定差别的。ssmethylseq和cpgiant覆盖大约70％的相同cpg，truseqepic和其它捕获方法捕获的共同cpg约为40-50％，而rrbs只有~30％的捕获区域与其他捕获方法重叠ssmethylseq，cpgiant和truseqepic在他们设计的捕获区域中覆盖率超过90％，而rrbs对其预期靶向区域的覆盖率约为70％。因此，基于捕获的甲基化测序平台比rrbs更精确地覆盖了它们的预期靶向区域。

2. rrbs可提供与捕获平台相当的cpg数据，但在cpgs谱中提供更多的可变性（即未知区域的数据）。

3. 甲基化水平检测在不同平台之间主要是检测区域的差别，而检测出的甲基化水平是高度一致的。

4. 安捷伦和罗氏还为甲基化的测量设计个性化定制捕获。

5. 安捷伦ss methyl seq捕获平台可用于低质量dna（降解）的甲基化水平检测，是ffpe组织的一个理想甲基化检测平台。