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发稿时间：2018-01-12来源：天昊生物

  

中国科学院地理与湖泊研究所近期在《fems microbiology ecology》上发表了微生物参与淡水生境中植物凋落物分解的文章。在这项研究中天昊生物有幸承担了样品的扩增子测序工作。在恭喜客户又发表文章同时，我们想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文题目：microbes participated in macrophyte leaf litters decomposition in freshwater habitat

中文题目：微生物参与淡水生境中植物凋落物分解

期刊名：fems microbiology ecology      

发表时间： 2017年    

影响因子：3.72

研究目的

关于淡水湖泊植物凋落物分解过程中涉及的水生微生物的知识仍然很少，本文使用原位试验（150天）对三种水生植物（茭白、黑藻、杏菜）凋落物分解过程及其相关微生物进行研究从而回答以下3个问题：

1）  哪些类型的细菌和真菌参与植物凋落物在表层沉积物的分解？

2）  调节植物凋落物分解过程中的细菌和真菌群落组成的主导因子是什么？

3）  微生物分解过程中细菌和真菌之间的主要关系是什么？

     研究对象

     水生植物茭白（zl）、黑藻（hv）、杏菜（np）新鲜叶片从东太湖湾收集。样品储存在无菌塑料袋，放置在冰上并在24小时内并运到实验室。叶片组织用去离子水轻轻冲洗去除表面杂质，然后300×g室温离心10 min 除去水份。使用消毒刀将预处理的组织被切成2-5厘米，每片落叶的15克放置在一个5mm的玻璃纤维网格袋中。将袋子用石块绑在渔网上，然后在2-3米深的沉积物表面悬挂，所有的渔网都系上了绳子，紧紧地绑在岸上。然后在第0、5、10、20、30、60、90、150、210、270和330天进行取样，每个时间点取4个生物学重复。整个实验在150天后停止，每个物种的网袋分别合并然后进行后续分析。另外收集500毫升环境湖泊水用于化学分析，例如总氮含量（tn）、总磷（tp）和总有机碳（toc）。

植物凋落物组成和水解酶活性测定：

5 g预分离组织冻干并磨成均匀的细粉末，测定冻干组织的碳含量（c）、氮含量（n %）、磷含量（p %）、纤维素含量、半纤维素含量、木质素含量。

离心后，1 g植物凋落物和9毫升pbs缓冲液混合,并在冰上孵育15分钟，匀浆1510 g离心20 min，上清液用于测定纤维素酶、木聚糖酶、多酚氧化酶和过氧化物酶活性。

dna提取：

附生微生物通过30秒震颤（10 × g）和5分钟超声波处理从植物组织脱离下来。使用0.2μm孔径的聚碳酸酯过滤器(millipore, usa)收集含有附生微生物的悬浮液。该过滤器存储在–80度直到进一步的核酸提取。该过滤器被切成小块，使用e.z.n.a water dna kit d552501 (omega biotek, norcross, ga, usa)提取基因组dna。

测序技术：细菌16s rrna扩增子测序（v4）和真菌18s rrna扩增子测序（v9）

数据库：16s rrna（rdp数据库）；18s rrna（silva数据库）

研究结果：

不同植物凋落物的分解率、材料组成和酶活性

◆ 网袋中黑藻（hv）和杏菜（np）超过98%的生物量在90天后消失，而茭白（zl）超过64%的生物量在150天后消失（图1a）。

◆ 基于指数衰减模型（生物质损失转化为分解速率, 用k值表示），不同植物变化明显不同（图1b）。在早期阶段k值的顺序是kzl < khv < knp，在后期，khv值高于knp。kzl最初先增强后下降，khv和knp均表现为持续下降趋势。

图1 三种植物凋落物在150天试验中的剩余生物量（a）和分解速率（b）

◆ 碳和氮含量随着降解过程逐渐减少（图2）。hv和np的磷含量随着降解过程逐渐减少，zl相对比较平稳。

◆ np的c/n比在降解的初始阶段增加，hv和zl则是先上升后回落。

◆ 在实验开始时，纤维素和木质素含量在zl中最高，在np中最低，半纤维素含量在hv最高。zl和np的纤维素和半纤维素含量随着分解进程逐渐增加而hv则是下降。随着时间的推移所有三种植物的木质素含量略有变化，最低值出现在第20天。

◆ 纤维素酶活性在zl中随着分解进程显著增加，然而，hv的纤维素酶活性在头几天则受到明显抑制。木聚糖酶活性在np样品中弱增强。多酚氧化酶活性只在zl和np样本中启动。过氧化物酶活性在np样本中显著增强，但变化幅度较大。

 

图2 植物凋落物在分解进程中的养分含量、物质组成和酶活性

在分解过程中的细菌和真菌群落组成

◆ 细菌α多样性随着降解时间显著增加，三种植物的细菌α多样性变化也不同（图3）：zl和np的α多样性指数（shannon–wiener 和faith’s pd）随时间增加而增加，而hv的α多样性指数增加至30天，然后下降。pielou’s 指数增加了30天，然后在接下来的时间内保持稳定，表明细菌群落的均匀度随着分解过程而增加。

◆ 真菌α多样性随着降解时间而增加（图3）：hv样本的真菌otus丰度和faith’s pd随时间增加而增加，在第30天达到最高峰，zl和np 样本则是在10天略有下降，然后增加到实验结束。zl和np样本的shannon–wiener和 pielou’s指数分别在第5和2天出现最低值，hv样本则是先升后降，然后再上升。

 

图3 三种水生植物分解过程中细菌和真菌群落的α多样性指数

 ◆细菌优势菌是厚壁菌门，β-变形菌纲，γ-变形菌纲，拟杆菌门，蓝细菌，δ-变形菌纲和α-变形菌纲（图4a）。γ-变形杆菌（gammaproteobacteria）在所有样品的初始阶段丰度最高，然后逐渐减少，而厚壁菌门（firmicutes）, β-变形菌纲（betaproteobacteria）, δ-变形菌纲

 

图4（a） 植物凋落物分解过程中的优势细菌门及其贡献

◆ 真菌优势门是cryptomycota（隐真菌门），chytridiomycota（壶菌门），basidiomycota（担子菌门）。在降解初期，zl 和hv样本丰度最高的是 basidiomycota（图4b）。chytridiomycota在np样本的初始阶段丰度最高。cryptomycota的相对丰度在分解过程中显著增加，其在np，hv和zl样本中的最高值分别出现在第20, 30天和150天。

 

图4（b） 植物凋落物分解过程中的优势真菌门及其贡献

◆ 从5541个otus中选择了18个common bacterial otus（图5a）, 在这18个otus中有7个otus相对均匀分布在三个植物中，两个属于bacteroidetes的otus在zl样品中更丰富，otu4227b（属于cyanobacteria）是np样本特异拥有的。specific bacterial otus则在三个植物中分布不均匀（除了otu637b）（图5b），zl样本有8个specific bacterial otus，hv样本有3个，nv样本没有任何specific bacterial otus。

◆ 从614个 otus中选择了18个common fungal otus（图5c），属于chytridiomycota和cryptomycota。4个otus在hv样本中富集，特别是otu610f。 属于chytridiomycetes的otu428f在是np样本中富集。属于basidiomycota的2个otus在zl样本中富集。19个specific fungal otus中大部分只在某种植物中存在（除了otu113f 和otu77f）（图5d）。属于opisthokonta的otu595f只在hv样本中存在，属于basidiomycota的2个otus和属于opisthokonta的2个otus只在zl样本中存在，7个大部分属于chytridiomycota的otus只在np样本中存在。

 

图5 植物凋落物分解过程中的common 和specific细菌otus（a和b）以及真菌otus（c和d）

微生物群落与凋落物特征以及环境因素的关系

◆ rda分析发现环境水体中的总磷（tp）和剩余凋落物的c%与细菌和真菌群落组成显著相关（表1和图6）。凋落物的c/n比和纤维素酶（cellulase）活性只与细菌群落组成有显著相关性。在分解过程中，环境水体中的总氮（tn）、n%、p%、 n/p、木聚糖酶（xylanase）活性与真菌群落组成呈显著相关。

表1  水环境因子和植物特征与细菌和真菌群落组成的线性回归分析

◆ 从rda二维图可以看出，整个降解过程可以分为三个阶段：初期（0天）、中期（5-30天）和后期（60-90天）（图6a和b）。影响微生物群落动态的因素也各不相同：在初始阶段，水体总磷（tp）对微生物群落组成有显著影响; 在中期，凋落物的c%和c/n比对细菌有影响，而n/p和木聚糖酶（xylanase）活性与真菌群落有一定的相关性。在后期，纤维素酶（cellulase）活性与细菌群落动态明显同步。

 

图6  使用rda揭示环境和生理因素与细菌（a）和真菌（b）群落组成的相关性

 

研究结论

1.杏菜（np）凋落物分解是最快的，而茭白（zl）凋落物分解是最慢的。

2.细菌群落和真菌群落的α多样性显著增加，群落结构随着时间推移表现出明显的变化。

3.对于细菌，γ-变形杆菌的相对丰度下降，而厚壁菌门, β-变形菌纲, δ-变形菌纲和α-变形菌纲增加。在所有三种植物中，真菌的优势物种cryptomycota（隐真菌门）显著增加。

4.细菌和真菌与水中总磷量以及凋落物中碳含量显著相关。

5.凋落物中氮含量、磷含量和n/p的动态变化对真菌群落的影响大于对细菌群落的影响。而纤维素酶和木聚糖酶活性与细菌和真菌群落有显著的相关性，从而了反映细菌和真菌在凋落物分解中的生态位分化和协同作用。