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发稿时间：2017-11-03来源：天昊生物

副标题：结直肠癌竟然可以用口腔菌群来筛查！

英文题目：the oral microbiota in colorectal cancer is distinctive and predictive

中文题目：结直肠癌的口腔菌群是独特的，可以用来预测结直肠癌

期刊名：gut            发表时间： 2017.10           影响因子： 16.658

研究对象：

99名crc患者，32名结肠直肠息肉患者，103名对照者的口腔拭子、结肠粘膜和粪便样本

技术手段：16s rrna 扩增子测序（v3-v4）

研究背景： 

肠道菌群变化与结肠直肠癌(crc)显著相关，值得注意的是结肠肿瘤患者含有丰度较高的细菌。然而目前尚不清楚结肠粘膜相关细菌类群是否是口腔衍生的，或者这种情况只是某些患者的特有情况，或者口腔菌群适合用来筛选crc患者。

研究结果：

1、 与对照相比crc患者的口腔菌群差异很大

所有口腔拭子样本中10个最丰富的细菌属分别是：链球菌（30.7%），嗜血杆菌（14.2%）、奈瑟菌（8.8%），普雷沃菌（6.6%），具核梭杆菌（5.4%），韦荣球菌（5.4%），纤毛菌（3.9%），罗思氏菌（3.9%），放线菌（2.9%）和卟啉单胞菌（2.4%）。这些微生物丰度比例与以前口腔微生物研究中所报道的相似。与对照相比，crc患者的口腔菌群差异很大。有7个otu出现明显差异：haemophilus, parvimonas,prevotella, alloprevotella, lachnoanaerobaculum, neisseria，streptococcus，这些差异菌绝大部分在crc患者中丰度更低。尽管对照组和息肉患者的整体菌群结构相似，仍然有4个otu存在丰度差异，这其中有3个otu也在crc患者中存在差异。

图1. pcoa分析显示结直肠癌患者和对照者存在口腔菌群显著性差异。

2、 口腔和粪便微生物群可作为结直肠癌标志物

目前非侵入性筛查工具是基于追查结肠病变释放的便血来检测晚期癌症，但是这些方法检测早期病变的敏感性很差。根据上述发现，基于rf分类方法评估了口腔微生物作为识别息肉和结肠直肠癌患者筛检工具的适宜性。这个模型鉴定了16个口腔微生物可以用于区分crc患者和健康人，检测灵敏度达到53%，检测特异性达到96% (auc: 0.9)（图2）。这个模型鉴定了12个口腔微生物可以用于鉴别结肠息肉患者，检测灵敏度达到67% (95% ci：23.81% - 90.48%) (auc: 0.89)。然而使用粪便微生物建立的模型来鉴别crc患者的灵敏度相当低，检测灵敏度达到22%，检测特异性达 95%(auc: 0.81)。结合26个粪便微生物和12个口腔微生物群可以将该模型针对crc患者的检测灵敏度增加至76％(auc: 0.94), 结合34个粪便微生物和29个口腔微生物群针对息肉患者的检测灵敏度增加至88％(auc: 0.98) （图2）。

图2. 使用来自从口腔，粪便或两者组合来预测crc患者（a）和息肉患者（b）的roc曲线及auc值。fpr，假阳性率； tpr，真阳性率。

3、 crc和结肠息肉患者含有丰富口腔细菌

很多研究发现crc和结肠息肉患者含有丰富的口腔细菌，这些细菌与炎症性宿主反应有关，并且加速结直肠癌发展。本研究关注口腔、crc和结肠息肉患者组织样本共有的17个otu。基于它们在肿瘤样本中的丰度对它们进行聚类（图3a），发现两个肿瘤相关的cag：

1） 第1个cag，属于口腔病原菌，它们与口腔生物膜的晚期定植和crc发生有关(定义为oral pathogen cag，包括7个out) ，如f. nucleatum, parvimonas micra, peptostreptococcus stomatis, dialister pneumosintes。

2） 第2个cag是早期牙生物膜形成过程的优势菌，它们主要与 健康牙周袋形成相关(定义为biofilm cag，包括10个out)，如actinomyces, haemophilus, rothia, streptococcus，veilonella spp.。

3） 相对于健康对照，这个两个cag在肿瘤on 和off 组别丰度更高（图3b）。

图3. 结肠粘膜中检测到口腔细菌，并在crc组富集。a. 17个与肿瘤组织相关的口腔out聚类成2个cag。b. 口腔病原体cag和口腔生物膜cag在crc患者结肠部位丰度更高。

4、 口腔粘膜和结肠组织具有类似的细菌网络

分析了不同疾病阶段和不同样本类型的口腔细菌网络，结果发现：结直肠癌活检组织发现的细菌网络（图4a）与口腔拭子（图4b）以及结肠直肠癌和结肠息肉患者健康组织样本（图4c）类似。另外口腔环境细菌类网络与健康人的组织样本也很相似（图4d），这表明这些细菌网络在crc发展之前就存在，并且参与到crc发生过程中。从结肠癌或息肉者粪便样本（图4e）和健康对照组粪便样本中（图4f）只能检测到部分网络,这表明粪便样本在检测crc患者菌群方面具有局限性。

图4. 结肠粘膜表面（a、c、d）检测到的细菌网络与口腔粘膜表面（b）检测到的细菌网络相似，而粪便样本中没有或仅仅检测到部分细菌网络（e、f）。a. 病变结直肠组织;  b.口腔拭子样本; c. 结肠直肠癌和结肠息肉患者健康组织样本; d. 健康人的组织样本;  e. 结肠癌患者或息肉者粪便样本；f. 健康对照组粪便样本;

5、 低丰度毛螺旋菌有利于与crc相关口腔病原体定植肠黏膜

考虑到口腔细菌与结肠直肠癌活检组织菌群改变相关，以及口腔细菌可用于筛查crc，因此推测口腔菌群可能普遍反映肠道菌群组成。然而在口腔和结肠都存在并且在结直肠癌组织显著富集的细菌通常在crc患者的口腔黏膜中比健康者少。此外crc患者口腔部位检出的口腔病原体cag细菌总数也较低。因此想知道人体（无论患癌与否）的总体肠道菌群组成是否决定口腔细菌成为肠道菌群的一部分。

l 首先确定了结肠病变部位（图5a）和正常人结肠黏膜的细菌cag：在crc患者富集的cag主要包括bacteroidetes, prevotella和口腔细菌cag，而毛螺旋菌cag（产丁酸梭菌，能降低crc风险）在crc患者中较少（图5a）。

l 无论是结肠病变部位还是正常人结肠黏膜，口腔病原体cag与毛螺旋菌cag都呈强负相关（图5a，深绿色cag），实际上96%的口腔细菌与毛螺旋菌cag呈负相关。

l 接着评估了结直肠癌部位口腔细菌的发病率：结果发现尽管口腔病原体cag和口腔生物膜cag在crc患者结肠部位丰度更高，但是只在40%–70%结直肠癌部位定植（图5b）。

l 毛螺旋菌cag丰度和西方式饮食呈负相关，这表明crc相关口腔细菌在肠道的定植与可能部分由高脂肪和碳水化合物的西方饮食所介导。

l 以上结果表明结肠直肠癌，结肠息肉及具有低丰度毛螺旋菌个体更容易在结肠部位发生口腔细菌的定植。

图5. crc患者结肠粘膜口腔细菌定植与处毛螺旋菌丰度负相关。a. 结肠病变部位口腔病原菌（亮红色）的相对丰度与毛螺旋菌（深绿色）丰度负相关。b. 口腔病原体cag和口腔生物膜cag在结肠部位的发病率。

6、 口腔细菌与非肿瘤性结肠疾病

为了确定口腔细菌在结肠定植是否只发生在老年人。把本研究数据（v4区序列）和300个cd（克罗恩病）儿童患者和健康对照者的16s数据（v4区序列）进行比较分析。结果发现和crc结果一样，cd儿童患者的病原cag也包括口腔来源细菌（图6a）。crc患者和cd患者具有以下共同细菌：fusobacterium,haemophilus, streptococcus, gemella, rothia, actinomyces,granulicatella，veilonella。而peptostreptococcus，parvimonas只在crc患者中存在（图6b）。这两种疾病共有的口腔菌种具有类似的网络（图6 c-e）。类似于crc，cd患者中口腔细菌的丰度与毛螺旋菌的丰度呈负相关。

图6.非肿瘤性和肿瘤性结肠疾病细菌谱具有相似性。a.有无cd疾病儿童直肠组织菌种相关性的heatplot图。b. cd患者结肠，crc患者结肠肿瘤和口腔拭子细菌的维恩图。c–e. 在口腔和不同结肠组织样本中发现的细菌网络图，（c）crc肿瘤；（d）cd粘膜；（e）健康对照者黏膜。