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发稿时间：2017-10-19来源：天昊生物

副标题：四管齐下：宏基因组 代谢组粪菌移植扩增子测序！

 

英文题目：gut microbiota dysbiosis contributes to the development of hypertension

中文题目：肠道菌群失调导致高血压的发生

期刊名：microbiome       发表时间： 2017           影响因子： 8.496

发表单位：中国医学科学院阜外医院高血压中心

技术：

l 宏基因组测序(gm) ：41名对照者（control）、56例高血压前期患者(phtn)、99例原发性高血压患者(htn)的粪便样本

l 代谢组（lc/ms）：30名对照者（control）、31例高血压前期患者(phtn)、63例原发性高血压患者(htn)的空腹全血样本

l 粪便移植无菌小鼠: 对照组小鼠n=5、htn组小鼠n=10

l 受体小鼠粪便16s rrna扩增子测序（v4）

筛选标准：所有高血压患者都是最新诊断的高血压患者，并且都没进行过降压治疗。有癌症、心力衰竭、肾衰竭、吸烟、中风、外周动脉疾病和慢性炎症性疾病的患者被排除。不能使用以下药物，包括他汀类药物、阿司匹林、胰岛素、二甲双胍、硝苯地平和美托洛尔。过去8周内不能接受抗生素或益生菌治疗。除了收缩压和舒张压外，其它临床参数在患者和对照者之间均无显著性差异（除了空腹血糖水平有差异）。

研究背景： 

最近，肠道微生物在代谢性疾病中的作用已经显露出来，尤其是在心血管疾病。高血压是世界范围内最常见的心血管疾病之一，然而肠道菌群失调是否参与高血压的发生发展仍然是未知的。为了探讨这个问题，本文对健康对照者、高血压前期患者、原发性高血压患者进行了全面的宏基因组学和代谢组学分析，并将高血压患者粪便菌群移植到无菌小鼠，观察其是否出现高血压症状。

研究结果：

1、 微生物多样性和肠型分析

稀释性曲线结果表明所测数据量已经足够发现绝大多数基因。对照组新基因速率超过疾病组新基因获取速率，提示高血压前期患者(phtn)和原发性高血压患者(htn)的基因丰富相对较低（图1a）。与对照组相比，phtn和htn组的基因数量显著性减少（图1b）。在属水平phtn和htn组的肠道菌群a多样性显著降低（图1c）。这些结果表明高血压患者肠道菌群减少。

196个样本分可以为两个不同的肠型（图1d）：肠型1（prevotella）和肠型2（bacteroides）. phtn和htn组具有更多比例的prevotella肠型，而健康对照组具有更多比例的bacteroides肠型（图1f）。

 

图1. 高血压患者微生物多样性降低，肠型发生转化

2、 与高血压相关的菌属

44个菌属在组间存在差异（图2a）。prevotella和klebsiella菌在phtn和htn组中显著增加（图2b）。prevotella起源于口腔和生殖道，牙周病和风湿性关节炎与prevotella相关。许多传染病认为是klebsiella造成的。相比之下，faecalibacterium, oscillibacter, roseburia,bifidobacterium, coprococcus, butyrivibrio在健康人群富集（图2b）。faecalibacterium（柔嫩梭菌）和roseburia（罗斯氏菌）丰度下降已知与克隆氏氏病和溃疡性结肠炎发生相关，这两种细菌都是丁酸生产的关键菌。这表明prevotella和klebsiella菌的过度生长可能在高血压的病理中起重要作用。同时需要注意的是，高血压前期组（phtn）已经具有与高血压组（htn）类似的微生物群落。这表明肠道菌群变化可能早于高血压的形成。

 

图2. 各组间的差异菌属分析

3、 phtn和htn组中显著富集的cag

与对照相比，分别有316和372个cag在phtn和htn组得到富集。对照组中显著富集的cag主要来自firmicutes和roseburia（图3a，b）；phtn组富集的cag主要来自enterobacter（肠杆菌，一种与肥胖有关的致病细菌）；隶属于fusobacterium和klebsiella的cag在phtn和htn组得到富集。

 

图3. 与对照相比，上调或下调菌类型的相关网络分析。cag为至少包含50个连锁基因的基因簇。节点的大小表示该cag的基因数量。节点的颜色代表了它们所属分类。斯皮尔曼相关系数值大于0.8用红色线段连接，0.7-0.8用灰色线段连接。

4、 临床指标与cag细菌相关性分析

将临床指标包括收缩压（sbp）、舒张压（dbp）、体重指数（bmi）、空腹血糖（fbg）、总胆固醇（tc）、甘油三酯（tg）和低密度脂蛋白（ldl）与cag进行spearman相关分析。结果发现：sbp和dbp可以负调控对照组富集的cag（例如firmicutes、roseburia），可以正调控phtn和htn组富集的prevotella和desulfovibrio。而tc和tg与phtn和htn组富集的enterobacter呈负相关（图s6）。这些结果表明phtn和htn组的细菌群落很相似，这些细菌的集体效应可能与
高血压患者的肠道微生态失调相关。表明phtn和htn组的细菌群落很相似，这些细菌的集体效应可能与高血压患者的肠道微生态失调相关。

 

图s6. 临床指标与cag丰度相关性分析。正相关用红色表示，负相关用蓝色表示， : p值＜0.01；*: p值＜0.05。

5、 phtn和htn组菌群功能的改变

健康组和高血压组在肠道菌群基因功能上具有明显差异（图4a）。无论是kegg modules（图4b）还是碳水化合物活性酶类（图4c），与对照组相比，phtn和htn组都有类似的差异，说明phtn和htn组肠道菌群功能很类似。39个kegg modules在phtn和htn组减少，主要包括：支链氨基酸的合成运输、酮体生物合成、双组分调节系统、甲硫氨酸和嘌呤降解（图4b），这些代谢功能对宿主是必不可少的。17个kegg modules在phtn和htn组升高，主要包括：lps合成运输、磷脂运输、磷酸转移酶系统（pts）、

苯丙氨酸和磷脂酰乙醇胺合成、分泌系统（图4b）。phtn和htn组的纤维素结合结构域相关基因显著富集但是glycan-utilizing enzymes相关基因显著减少（图4c）。

 

图4  phtn和htn组微生物基因功能注释。 a.196个样品kegg orthology相对丰度比较。 b.各组间肠道微生物kegg modules的差异比较。c. 各组间肠道微生物cazy家族丰度的差异比较。

6、 各组间肠道菌群代谢物比较分析

因为肠道菌群的代谢产物可以进入血液并可以影响宿主的生理机能，利用lc/ms对124个样本的血清进行代谢物分析，进而对肠道菌群和代谢物进行相关性分析。pls-da分析能把代谢物在健康组、phtn和htn组明显分开（图5a、b），其中phtn和htn组的肠道菌群代谢产物非常类似。对照组和phtn共有167个代谢物有差异，对照组和htn组共有215个代谢物有差异（图5c）。值得注意的是，phtn和htn组的代谢产物变化非常类似，这与前面的肠道菌群变化紧密相关（图5d）。3,4,5-三甲氧基肉桂酸、溶血磷脂酰胆碱（lysopc）、s-羧甲基-l-半胱氨酸和溶血磷脂酰乙醇胺（lysope）在phtn和htn组明显减少。n-乙酰- l -精氨酸α、硬脂酸、磷脂酸（pa）和葡萄糖苷在在phtn和htn组明显增多。微生物菌群与代谢产物有相关性：对照组富集的三氯葡萄糖醛酸与bifidobacterium、akkermansia正相关，但是与prevotella呈负相关。htn组富集的klebsiella、prevotella、 enterbacter与硬脂酸呈正相关，而硬脂酸与bifidobacterium、roseburia呈负相关。

 

图5  phtn和htn组的异常代谢模式。 a.不同组别血清代谢谱的pls-da分析。 b. 不同组别血清代谢谱的散点图分析。 c. 在phtn和htn组发生明显变化的代谢物。es ：离子模式，es−：负离子模式。d.不同组别血清代谢产物的差异比较。e. 26种内源性代谢物与44个菌属的spearman相关性分析。对照组：绿色，高血压组：粉红色。

7、 建立识别高血压病人的的诊断模型

建立了基于cag和代谢物的高血压疾病诊断模型，此诊断模型可以准确区分高血压患者和健康人，auc值分别为0.91，表明此模型很准确（图6a），另外此诊断模型也可以准确区分高血压前期患者和健康人，auc值分别为0.89（图6b）。此模型不能有效区分phtn和htn组（图6c）。phtn和htn组区别与对照组的一些cag是共同的：例如cag-172 (prevotella), cag-197(prevotella), cag-759 （faecalibacterium), cag-765(faecalibacterium), and cag-793 (faecalibacterium) （图6d、e）

 

图6  建立了从对照组准确区分高血压前期和高血压患者的疾病分类器

8、 粪便移植可以导致血压升高

在这项研究中，似乎高血压的主要原因是肠道微生态失调，因此，本文想研究是否可以通过微生物移植来改变血压。因此把高血压患者的粪便移植到无菌小鼠体内，来看看这些无菌小鼠的反应。本研究的微生物移植供体包括两例高血压患者和正常血压对照者。8～10周的小鼠分为两组(对照组n=5, htn组n=10 )，分别口服接种供体粪便样本（图7a）。喂养7天后使用通过16s扩增子测序研究受体小鼠的粪便样品。从高血压患者成功定植到无菌小鼠128个菌属。从健康对照者成功定植到无菌小鼠110个菌属（图7b）。香浓指数表明htn组小鼠细菌多样性少（图7c）。pcoa分析表明高血压患者和对应受体小鼠菌群结构类似，而对照健康人和对应受体小鼠的菌群结构类似（图7d）。属水平上，anaerotruncus, coprococcus, ruminococcus, clostridium, roseburia, blautia, bifidobasterium在htn组小鼠较少（图7e），而coprobacillus和prevotella则在htn组小鼠富集，这与前面的人宏基因组分析结果一致。移植后10周，与对照组相比，移植了htn粪便的小鼠表现出显著较高的收缩压（sbp），舒张压（dbp）和平均血压（mbp）（图7f）。

 

图7粪便移植后的受体小鼠肠道微生物分布及血压统计。

总结：

l 与健康对照者相比，phtn和htn组的微生物丰富度和多样性显著下降。

l phtn和htn组具有更多比例的prevotella肠型。

l phtn和htn组中有益菌明显降低、prevotella和klebsiella等有害菌过度生长。

l phtn和htn组中与疾病相关的微生物功能和基因显著富集。

l phtn和htn组的微生物和代谢产物变化非常相似，表明phtn和htn组的代谢产物改变与微生物组的改变密切相关。

l 建立了基于菌群和代谢物的疾病诊断模型，能准确区分对照组和高血压前期、高血压患者。

l 将高血压患者粪便移植到无菌小鼠，结果无菌小鼠血压升高。