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发稿时间：2021-03-03来源：天昊生物

胆碱是一种必需的营养物质，也是甲基的主要饮食来源，对大脑发育至关重要。母体孕期饮食中的低胆碱（lc）会改变胎儿大脑的神经发生，并导致较低的认知能力。但是，胎儿神经祖细胞（npc）发育期间对母体胆碱供给敏感性的关键信号传导途径，以及胆碱调节基因表达的表观遗传机制仍不完全清楚。在e11-17期间，给怀孕的nestin-cfpnuc转基因小鼠喂食对照饮食或lc饮食，通过转录组测序鉴定出e17时期npc中的基因表达变化。母体lc饮食显着增加tlr4转录，导致神经元过早分化，并增强乙醇诱导的nlrp3炎性小体活化。在tlr4基因启动子区域未检测到dna甲基化的改变；但是，在lc处理的npc中，h3k27me3降低了70％。抑制ezh2可降低h3k27me3水平并增加tlr4表达。相反，使用具有无催化活性cas9的ezh2来增加tlr4启动子上的h3k27me3会导致tlr4表达降低。这些结果揭示了母体胆碱的利用对胎儿大脑发育影响的表观遗传机制，提示了对神经发育疾病进行干预的可能性。

母体胆碱的可用性对胎儿大脑发育至关重要。在妊娠早期，母体饮食中胆碱摄入量低会增加胎儿神经管闭合缺陷。在妊娠后期，低胆碱(lc)母体饮食导致e11-17小鼠胚胎皮质和海马体的持续变化，这是神经发生的敏感窗口。本文研究者曾经报道过，由于母体胆碱摄入量低会造成细胞周期提前结束、神经祖细胞(npc)增殖减少和神经元分化加速，从而导致永久破坏胎儿大脑皮层中第ii–iv层和第vi层的形成。此外，在怀孕期间吃lc食物的母鼠所生的后代对长时程增强作用不敏感，成年后视觉空间和听觉记忆下降。虽然孕期母体摄入足够胆碱对后代的正常认知能力至关重要，但其潜在的分子机制仍不清楚。

本研究检测了小鼠母体低摄入胆碱量对胎鼠神经发生过程中表观遗传机制的影响。在这里，研究者报道了toll样受体4 (tlr4)信号通路对胎儿神经原细胞的神经元分化和神经炎症至关重要。本文还首次证明了h3k27me3在特定基因调控中的功能相关性，这是通过使用基于crispr/dcas9的工具编辑npcs tlr4基因座的h3k27me3而揭示的。这些发现阐明了表观遗传变化和胆碱可用性之间的因果联系，胆碱可用性改变了大脑的发育过程。

本文使用c57bl/6j背景的nestin-cfpnuc转基因小鼠(其中cfp与nestin调控元件驱动的nls融合)。在所有实验中，8-15周龄的雌性小鼠进行受孕。在e11结束时，将动物随机分配到2个喂养组之一：ct (1.10 g氯化胆碱/kg)和lc (0 g氯化胆碱/kg)，动物被喂食这些食物直到e17。e14 npcs细胞根据之前报道方法进行分离和培养，在含有70 μm氯化胆碱(对照)或5μm氯化胆碱(lc)的培养基中处理。

rna-seq由上海天昊生物科技有限公司进行。从e17 nestin-cfpnuc小鼠收集皮质cfp npc样品，并从提取的样品构建rna测序文库，然后使用标准illumina文库制备方案扩增rna。rna-seq是在illumina hiseq 2500平台上进行的。此外，本研究还进行了qrt-pcr、western blot杂交、焦磷酸测序、h3k27me3染色质免疫沉淀(chip)，以及基因编辑实验等。

rna-seq分析确定了lc处理的e17 npcs转录谱的显著变化

利用转录组测序获得了差异表达基因热图(图1a)。与对照npcs细胞相比，在lc中暴露的npcs细胞大多数基因(80%)表达上调，表明处理的细胞中具有更活跃的转录过程。在火山图中，表达差异显著基因显示为红色(上调基因)和绿色(下调基因)(图1b)。kegg分析表明，在e17 npcs中，与轴突导向、tlr信号通路和细胞周期相关的基因受到lc的显著调节(图1c)。

选择这些功能类别进行验证，列出了lc npcs中10个最重要的上调基因(图2a)，并通过qrt-pcr进行验证，结果数据一致(图2b)。tlr4是受母体lc饮食显著影响的最高表达基因之一。使用蛋白质印迹法来证实经lc处理的e17 npcs中tlr4蛋白表达的显著变化(图2c)。这些发现促进了对由母体胆碱缺乏引起的npcs tlr4表达变化结果的研究。

随后研究者通过逆转录病毒感染等实验证明，tlr4过表达促进神经元分化但不促进npcs的增殖，但通过对tlr4敲降，可以恢复lc诱导的npc分化。tlr4在lc处理的npcs中加重乙醇诱导的nlrp3炎症小体的激活（原文图3-5）。

h3k27me3降低与lc处理的npcs中tlr4表达上调有关

lc条件下tlr4基因表达与npcs分化和炎症小体激活之间具有显著的正相关性，一个可能的机制是tlr4通过其dna和组蛋白甲基化状态来调控转录。研究者因此使用washu表观基因组浏览器(http://epigenomegateway.wustl.edu)搜索tlr4基因启动子的cpg位点和组蛋白甲基化富集位点。本文选择组蛋白修饰h3k4me3、h3k9me3和h3k27me3，因为h3k4me3与激活转录有关，而且h3k9me3和h3k27me3是启动子区转录基因沉默的标志。图6a显示了cpg位点的示意图，由rna聚合酶ii (polr2a) chip-seq信号和es-bruce4细胞系(一种小鼠胚胎干细胞系)的组蛋白修饰数据揭示的tlr4的转录活性。

这些数据表明表观遗传系统可能在皮层npcs tlr4表达中起重要作用。研究者首先进行焦磷酸测序，以确定在lc条件下tlr4启动子区域是否发生了dna甲基化水平的降低。从tlr4基因启动子到最接近tss的内含子1开始的10个cpg位点没有观察到可检测的dna甲基化变化(图6b)。然后研究者分析了组蛋白甲基化是否与lc暴露后npcs中的tlr4启动子相关。

chip-qpcr实验发现lc处理导致tlr4启动子h3k27me3的富集减少70%，而h3k4me3或h3k9me3水平没有显著差异(图6c)。为了确定h3k27me3标记减少是否激活tlr4转录，研究者将培养的npcs暴露于h3k27me3组蛋白甲基转移酶ezh2的抑制剂epz-6438中。在培养的npcs中，用epz-6438抑制ezh2导致h3k27me3的整体水平降低60%(图6d)，在tlr4启动子h3k27me3富集的显著减少情况下(图6e)，tlr4 mrna表达(图6f)和蛋白质水平(图6g)增加。这些结果表明由lc诱导的h3k27me3的降低与npcs中tlr4的上调有关。

h3k27me3的表观遗传编辑调节tlr4基因表达

为了进一步评估h3k27me3的变化是否为调节tlr4基因表达的原因，研究者设计并检测了几个小的grnas，它们定位在靠近tlr4 tss的保守h3k27me3富集位点(图6a，7a)。

然后用crispr/dcas9-ezh2系统的慢病毒感染npcs(图7b)。靶向tlr4的dcas9-ezh2系统转导后，tlr4阳性细胞在基因编辑细胞中的比例(由paprikarfp反应)与对照grna组相比显著降低，为了排除tlr4表达减少是由空间位阻而不是表观基因组编辑引起的可能性，研究者还导入了set结构域(ezh2*)中突变的ezh2，其具有非活性组蛋白甲基转移酶结构域。

靶向tlr4的dcas9-ezh2*的转导不影响tlr4阳性细胞的比例(图7c和d)，暗示表观基因组编辑通过h3k27me3标记修饰来抑制tlr4基因表达。为了测试由crispr/dcas9-ezh2引起的tlr4转录抑制是否与h3k27me3直接相关，本研究进行了chip-qpcr实验。与对照水平相比，dcas9-ezh2靶向tlr4后，tlr4周围的h3k27me3水平显著增加，但dcas9-ezh2*靶向tlr4后未观察到此类增加 (图7e)。基于crispr/cas9的表观基因组编辑研究结果表明h3k27me3可以改变靶基因tlr4在npcs中的表达。

本研究结果为tlr4在胎儿脑神经发生中的关键作用提供了第一个证据，并表明神经炎症和脑损伤可能是由母体摄入乙醇引起的。该结果还提供了关于神经发育过程中胆碱需求和单个基因水平上功能性组蛋白修饰变化的新信息。这些结果有助于我们理解饮食胆碱如何调节胎儿大脑发育，并可能为预防神经发育疾病的新干预策略的发展提供思路。

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